于有偉，閆可婧，陶瑋紅，趙雪竹，崔雨博，張少穎，葛巍峰，任玉林

（1.山西師范大學 食品科學學院，山西 臨汾 041004；2.青島佳禾味真源食品有限公司，山東 青島 266731；3.山西眾一農業(yè)科技股份有限公司，山西臨汾 041699）

花生餅粕是花生仁榨油后的副產物，形狀通常為小塊或粉狀，淡褐色，有輕微的花生香味[1]?；ㄉ炂删哂胸S富的營養(yǎng)價值，它的蛋白質含有多種氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸含量較高?；ㄉ炂傻鞍着c動物蛋白相近，且不含有膽固醇，具有很高的消化性，可用于生產醬油等調味品的原料[2]。小麥麩皮是指小麥經過研磨和篩理工序加工成面粉的過程中，除去打碎入粉的胚乳后剩下的物料，占小麥籽粒質量的14%～15%，而且富含膳食纖維、低聚糖、蛋白質、植酸，同時還含有一系列的天然抗氧化劑[3]。枯草芽孢桿菌屬于益生菌，菌體自身能夠合成蛋白酶、纖維素酶等酶類[4]。試驗選用枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵劑，花生餅粕經適度發(fā)酵后，所含的蛋白質分解成氨基酸和小肽類等物質。為了提高蛋白質的降解效果，添加適量的小麥麩皮。研究可為食品加工業(yè)副產物花生餅粕和小麥麩皮開發(fā)成高值化的調味品等產品提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

花生餅粕，青島佳禾味真源食品有限公司提供；小麥麩皮，山西眾一農業(yè)科技股份有限公司提供；枯草芽孢桿菌（Bio-52746），北京百歐博偉生物技術有限公司提供；福林酚試劑，上海源葉生物科技有限公司提供；3,5 - 二硝基水楊酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、羧甲基纖維素鈉等，均為分析純，天津市光復科技發(fā)展有限公司提供；其他試劑由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

1.2 儀器與設備

752N 型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產品；SHZ-B 型水浴恒溫振蕩器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司產品；LS-50HD 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，江蘇濱江醫(yī)療設備有限公司產品。

1.3 樣品處理

1.3.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生餅粕的過程

將花生餅粕粉碎→添加一定量的麩皮→采用121 ℃滅菌20 min→隨后冷卻接種→進行發(fā)酵。

1.3.2 菌種活化過程

首先配制營養(yǎng)肉湯種子培養(yǎng)基，50 mL 營養(yǎng)肉湯裝于250 mL 三角瓶中，然后包扎封口，于121 ℃，0.1 MPa 條件下滅菌20 min。將在37 ℃下斜面培養(yǎng)24 h 的枯草芽孢桿菌接入冷卻后的培養(yǎng)基。隨后在水浴恒溫振蕩器上以轉速200 r/min，溫度30 ℃條件下培養(yǎng)20 h。

1.3.3 花生餅粕的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)過程

取在5 個500 mL 的三角瓶，分別加入粉碎后的花生餅粕180 g，再分別加入0，10，20，30，40 g的小麥麩皮，料水比1∶1（g∶mL），121 ℃條件下，滅菌20 min，冷卻至35 ℃左右進行接種發(fā)酵培養(yǎng)。

1.4 指標測定方法

1.4.1 枯草芽孢桿菌計數(shù)方法

采用細菌涂片計數(shù)法計算發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌的數(shù)量[5]。

1.4.2 中性蛋白酶活性測定

參照李洪康等人[6]的方法測定中性蛋白酶的活性。

上清液（粗酶液） 的制備：稱取充分研磨的發(fā)酵物1.00 g，并用10 mL 的磷酸緩沖液（pH 值=7.5，適用于中性蛋白酶制劑） 充分溶解，過濾，即制得粗酶液待測。樣品酶活力的計算公式如下：

式中：X3——酶活力，U/g；

A2——樣品最終稀釋液的活力，U/mL；

V1——溶解樣品所使用的體積，mL；

4——反應試劑的總體積，mL；

n1——樣品稀釋倍數(shù)；

m4——樣品質量，g；10 min 反應時間，以1 min 計，所得的結果用整數(shù)表示。

1.4.3 可溶性蛋白質檢測

采用考馬斯亮藍G-250 法測定可溶性蛋白質的含量[7]。

1.4.4 纖維素酶活力測定

按文獻所示，采用CMC 糖化力法測定纖維素酶活性[8]。準確稱取發(fā)酵物1.00 g 置于研缽中，加入pH 值4.6 的醋酸緩沖液少量溶解，充分研磨后，將上清液轉移至25 mL 的刻度試管。向研缽中的沉渣再次加入少量緩沖液研磨3～4 次，最后全部移至試管中并定容至25 mL，搖勻，濾紙過濾，即制得待測酶液?？瞻讟拥闹苽鋾r，首先加入1.5 mL DNS 顯色試劑，然后加入0.5 mL 適當稀釋的酶液和CMC-Na溶液1.5 mL，按同樣方法測定其吸光度Ack。

由以下公式進行計算：

式中：P——根據(jù)ΔA（ΔA=As-Ack） 從標準曲線中查得葡萄糖含量，mg/mL；

K——稀釋倍數(shù)。

1.4.5 纖維素含量測定

利用蒽酮比色法進行測定纖維素含量，參考王偉等人[9]的方法進行測定。

1.4.6 氨基酸態(tài)氮含量測定

氨基態(tài)氮含量的測定采用甲醛值法[10]。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗中，各處理重復3 次；數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用DPS 9.01 軟件進行；采用Duncan's 新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌數(shù)目變化

麩皮用量對枯草芽孢桿菌數(shù)目的影響見圖1。

圖1 麩皮用量對枯草芽孢桿菌數(shù)目的影響

由圖1 可知，枯草芽孢桿菌隨著發(fā)酵時間的延長，數(shù)目在不斷增加。隨著麩皮用量從0 g 增加到20 g，枯草芽孢桿菌數(shù)目也隨著相應增加。從20～40 g 時，隨著麩皮用量的增加，枯草芽孢桿菌的數(shù)量反而減少了。麩皮用量為20 g 時，枯草芽孢桿菌的數(shù)目最多，在72 h 時達到4.21×109個/ mL，約是未加麩皮的2 倍。說明添加一定量的麩皮有助于枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生餅粕。添加適量麩皮可能會增加花生餅粕的透氣性，同時麩皮可以為枯草芽孢桿菌提供豐富的碳源，因此對于好氧菌芽孢桿菌的生長有利。但是，當麩皮用量過多時，有可能添加過多的麩皮會使芽孢桿菌生長所需要的C/N 比等營養(yǎng)比例不合適，反而不利于其生長，枯草芽孢桿菌數(shù)目反而減少[11]。

2.2 麩皮用量對中性蛋白酶活力的影響

麩皮用量對中性蛋白酶活性的影響見圖2。

圖2 麩皮用量對中性蛋白酶活性的影響

由圖2 可知，隨著麩皮用量從0 g 增加到20 g，中性蛋白酶的活性一直在增大。當麩皮用量為20 g時，其蛋白酶活力最大31.09 U/mL。隨著麩皮用量進一步增多，中性蛋白酶的活性開始下降。說明當麩皮用量為20 g 時，由于條件適宜，枯草芽孢桿菌生長較其他4 組好，有利于枯草芽孢桿菌產生中性蛋白酶。而當麩皮用量為0 g 時，蛋白酶活力為14.06 U/mL，這說明由于發(fā)酵培養(yǎng)基中僅添加花生餅粕，由于花生餅粕加水后呈小塊狀，透氣性不佳，枯草芽孢桿菌產生的中性蛋白酶少。當麩皮用量40 g時，蛋白酶活力僅為15.64 U/mL，過多的麩皮導致枯草芽孢桿菌生長所需要的營養(yǎng)相對減少，不利于枯草芽孢桿菌產生中性蛋白酶。

2.3 麩皮用量對可溶性蛋白質量濃度的影響

麩皮用量對花生餅粕發(fā)酵后可溶性蛋白質量濃度的影響見圖3。

圖3 麩皮用量對花生餅粕發(fā)酵后可溶性蛋白質量濃度的影響

由圖3 可知，隨著麩皮用量的增加，發(fā)酵后的花生餅粕中可溶性蛋白質量濃度先減少后增加。在麩皮用量為20 g 時，可溶性蛋白質量濃度最少為12.44 mg/mL，分別比麩皮用量為0 g 和40 g 的處理組低66.3%和68.3%。其原因可能是枯草芽孢桿菌可以產生中性蛋白酶，麩皮用量為20 g 時，枯草芽孢桿菌產生的中性蛋白酶活性最大，由于蛋白酶可以將大分子蛋白質降解為肽、氨基酸等小分子物質。

2.4 麩皮用量對纖維素酶活力的影響

麩皮用量對花生餅粕發(fā)酵后纖維素酶活性的影響見圖4。

圖4 麩皮用量對花生餅粕發(fā)酵后纖維素酶活性的影響

由圖4 可知，纖維素酶的活性隨著麩皮用量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。在麩皮用量20 g 時，纖維素酶活性最大，為107.30 U/mL，約是不添加麩皮的8 倍。麩皮中含有較多的纖維素，適當增加麩皮用量纖維素酶活性的提高；但是當麩皮用量超過多時，可能營養(yǎng)條件不再適合枯草芽孢桿菌生長，因此所產生的纖維素酶活性降低。

2.5 麩皮用量對纖維素含量的影響

麩皮用量對發(fā)酵花生餅粕中纖維素含量的影響見圖5。

圖5 麩皮用量對發(fā)酵花生餅粕中纖維素含量的影響

由圖5 可知，隨著麩皮用量的增多，發(fā)酵的花生餅粕混合物中纖維素呈現(xiàn)增加的趨勢。當麩皮用量為40 g 時，纖維素含量達到17.46%。原因可能主要有2 個方面，其一，由于麩皮本身含有豐富的纖維素。其二，過多的麩皮會使芽孢桿菌生長所需要的營養(yǎng)比例不合適，使其營養(yǎng)相對減少，不利于其生長。產生的纖維素酶活性也較低，分解的纖維素量也相應地減少[12]。

2.6 麩皮用量對氨基酸態(tài)氮含量的影響

麩皮用量對花生餅粕發(fā)酵后氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖6。

圖6 麩皮用量對花生餅粕發(fā)酵后氨基酸態(tài)氮含量的影響

氨基態(tài)氮是醬油等調味品的重要指標之一，主要是通過蛋白質的降解而形成的。由圖6 可知，與空白對照組中的氨基酸態(tài)氮含量為30.80 mg/100 g 相比，發(fā)酵后的花生餅粕中氨基酸態(tài)氮的含量都遠遠高于空白對照組。說明經過枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，氨基酸態(tài)氮含量增加。當麩皮用量為20 g 時，發(fā)酵花生餅粕中的氨基酸態(tài)氮含量最高，為428.40 mg/100 g，約是未發(fā)酵花生餅粕的14 倍。原因可能是枯草芽孢桿菌產生的蛋白酶可以將花生餅粕中的蛋白質大分子降解為肽、氨基酸等更小分子物質[13]；而且麩皮用量為20 g 時，枯草芽孢桿菌產生的蛋白酶活性最高。因此，麩皮用量為20 g 時氨基酸態(tài)氮含量高于其他試驗組。

3 結論

在枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生餅粕的過程中，適量添加小麥麩皮有助于促進枯草芽孢菌的增殖，提高中性蛋白酶和纖維素酶的活性，有助于將花生餅粕中的蛋白質降解生成更多的氨基態(tài)氮。180 g 花生餅粕最適宜的小麥麩皮用量為20 g。研究可為食品加工業(yè)副產物花生餅粕和小麥麩皮開發(fā)成調味品等產品提供一定的參考。