梁 可，喬 鐵，李芳瀟，鄭冰元，朱明丹

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847）

失眠癥又稱為睡眠障礙（sleep deprivation，SD），是指睡眠的始發(fā)和維持發(fā)生障礙，致使睡眠質(zhì)量不能滿足個(gè)體生理需要而顯著影響患者白天活動(dòng)的一種睡眠障礙綜合征[1]。隨著社會(huì)的飛速發(fā)展，人們的生活節(jié)奏不斷加快，工作生活壓力日益增大，越來(lái)越多的人患上失眠癥（如入睡困難、早醒、易醒等），長(zhǎng)期失眠可造成大腦感覺(jué)和智力的敏感度下降，引起社會(huì)功能障礙，甚至誘發(fā)抑郁及其他精神類疾病[2]。目前，西醫(yī)治療失眠癥以苯二氮?類藥物為主，其能通過(guò)選擇性地抑制腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的上行激活系統(tǒng)，迅速誘導(dǎo)患者入睡，但因具有成癮性、依賴性等不良反應(yīng)，臨床療效尚有爭(zhēng)議。

中醫(yī)稱失眠癥為“不寐”“不得眠”“不得臥”“目不暝”，認(rèn)為心主神明，心脾兩虛、心血不足等均可導(dǎo)致失眠。五味子，味酸、甘，性溫，歸肺、心、腎經(jīng)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功，可用于治療久嗽虛喘，夢(mèng)遺，滑精，遺尿，尿頻，久瀉不止，自汗，盜汗，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，心悸，失眠[3]。脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，可與腦連接共同影響機(jī)體的免疫功能[4]。本研究探討五味子對(duì)對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA）致失眠大鼠脾臟Toll樣受體7（TLR7）、干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7）、干擾素α（IFN-α）mRNA表達(dá)的影響，探討其改善睡眠的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，雄性，由遼寧長(zhǎng)生生物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001。

1.2 藥物與試劑 五味子（安徽普仁中藥飲片公司），PCPA（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：MB3073），地西泮片（安定，山東信誼制藥有限公司，批號(hào)：170601）；Trizol（美國(guó)Invitrogen公司），PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（Takara公司），SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ（TliRNaseH Plus公司），ROX plus（Takara公司），水合氯醛、氯仿、異丙醇、75%乙醇均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

1.3 藥物制備 ①五味子提取物：取五味子適量，10倍量乙醇加熱回流兩次，每次1.5 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮，干燥，加生理鹽水溶解，制成0.15 g/m L五味子提取物溶液（其中五味子醇甲含量約為0.43 mg/g）[3，5]。②安定混懸液：將地西泮片研成細(xì)末，加水制成0.025 g/m L的安定混懸液。

1.4 主要儀器 熒光定量PCR儀（德國(guó)安捷倫公司），蛋白核酸分析儀（美國(guó)貝克曼公司），低溫高速離心機(jī)（法國(guó)Jouan SA公司），Multiskan FC型酶標(biāo)儀（Thermo Fisher 公司）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組和給藥 SPF級(jí)SD雄性大鼠32只，基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成空白組、模型組、五味子組、安定組，每組8只。模型組、五味子組和安定組按0.3 g/kg體質(zhì)量確定PCPA混懸液給予劑量，腹腔注射，每日1次，連續(xù)4 d。于第5日起，五味子組給予五味子提取物灌胃，安定組給予安定混懸液灌胃，連續(xù)14 d?？瞻捉M、模型組不予處理。各組大鼠于末次給藥后24 h行水合氯醛麻醉（300 mg/kg），無(wú)菌條件下迅速摘取大鼠脾臟組織。

2.2 檢測(cè)方法 每個(gè)脾組織樣本取中段，約100 mg，加入1 m L Trizol，室溫放置5 m in；4 ℃離心10 m in；取上清液，加入0.2 m L氯仿；震蕩15 s，室溫放置5 min；4 ℃離心15 m in，使溶液分為三相；取上層水相0.4 m L，加入0.5 m L異丙醇；混勻，室溫放置10 m in，使RNA沉淀形成；4 ℃離心10 min；棄上清液，加入1 mL 75%乙醇，吹打、洗滌沉淀；4 ℃離心5 m in；棄上清液，空氣干燥至乙醇全部揮發(fā)；溶解RNA，取稀釋后的RNA樣品，檢測(cè)吸光度，計(jì)算RNA濃度。取0.5 μg RNA按10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。使用Primer-BLAST工具設(shè)計(jì)引物[6]，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。TLR7上游引物：5'-GTGCCTTCAAGAAAGATGCCATT-3'，下游引物：5'-TGGTGGAGGAGAACAGAGCTT-3'；IRF7上游引物：5'-TGAACTTAGCCCGGAGCTTG-3'，下游引物：5'-AGGGACATACCCTGTGTGGG-3'；IFN-α上游引物：5'-GTGGTCAAAGCAGAAGTCTGGA-3'，下游引物：5'-TCTTTCTTCTCTCAGTCTTCCCAT-3'。應(yīng)用熒光定量PCR儀檢測(cè)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火1 m in后采集熒光信號(hào)，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；在循環(huán)反應(yīng)后，按設(shè)定條件（95 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min，95 ℃30 s）測(cè)溶解曲線。在55 ℃升溫至95 ℃過(guò)程中，每升高0.5 ℃采集1次熒光信號(hào)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用方差齊性檢驗(yàn)，方差分析用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體征變化結(jié)果 造模后，模型組大鼠體質(zhì)量下降，出現(xiàn)毛少無(wú)光、易受驚、煩躁易怒、晝夜節(jié)律消失等現(xiàn)象。灌胃后，五味子組與空白組大鼠體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組大鼠體質(zhì)量明顯低于空白組（P＜0.01），安定組大鼠體質(zhì)量低于空白組（P＜0.05）。五味子組與空白組大鼠的身體狀態(tài)均相對(duì)較好，毛發(fā)有光澤，白天安靜倦臥，無(wú)煩躁、易怒等癥狀。各組大鼠體質(zhì)量見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量比較

3.2 五味子對(duì)PCPA致失眠大鼠TLR7、IRF7、IFN-α mRNA表達(dá)水平的影響 模型組TLR7、IRF7、IFN-α mRNA表達(dá)水平均明顯高于空白組（P＜0.01）；五味子組TLR7、IRF7 mRNA表達(dá)水平均明顯低于模型組（P＜0.01）；安定組TLR7、IRF7 mRNA表達(dá)水平均明顯低于模型組（P＜0.01），IFN-α mRNA水平低于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠相關(guān)基因m RNA表達(dá)水平比較（±s）

表1 各組大鼠相關(guān)基因m RNA表達(dá)水平比較（±s）

注：1.TLR7，Toll樣受體7；IRF7，干擾素調(diào)節(jié)因子7；IFN-α，干擾素α。2.與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

I F N-α m R N A表達(dá)水平組別 只數(shù) T L R 7 m R N A表達(dá)水平I R F 7 m R N A表達(dá)水平空白組 8 1.0 0±0.0 5** 1.0 0±0.0 7** 1.0 0±0.0 4**模型組 8 2.7 0±0.1 1 4.1 5±0.1 8 1.3 3±0.0 8五味子組 8 1.2 5±0.0 8** 2.6 9±0.1 1** 1.2 7±0.0 8安定組 8 1.5 8±0.1 0** 2.7 0±0.1 5** 1.2 5±0.0 7*

4 討論

免疫系統(tǒng)對(duì)睡眠有著重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)睡眠也直接影響免疫功能，長(zhǎng)期睡眠功能紊亂會(huì)嚴(yán)重影響免疫功能，導(dǎo)致感染、惡性腫瘤、抑郁癥等疾病[8-9]。Toll樣受體是一類信號(hào)傳導(dǎo)跨膜受體，在先天免疫和獲得免疫中有重要作用。TLR7主要分布在人體肺、脾臟等組織中，免疫細(xì)胞是主要表達(dá)TLR7的細(xì)胞，鼠類的TLR7與人高度同源[10]。TLR7經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜活化過(guò)程，介導(dǎo)相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，使共刺激分子、促炎因子釋放增加并激活I(lǐng)RF7因子，誘導(dǎo)IFN-α產(chǎn)生[11]。研究表明，TLR7高表達(dá)會(huì)使疾病發(fā)生率明顯升高，而降低則可以緩解疾病[12-13]。IRF7能夠在脾臟、淋巴結(jié)和骨髓中表達(dá)，可能是一種淋巴細(xì)胞特異性因子。激活后的IRF7在炎癥和腫瘤中具有促進(jìn)和抑制的雙向作用，具體作用可能隨微環(huán)境的不同而發(fā)生變化[14]。IFN-α能夠使T淋巴細(xì)胞進(jìn)行反向調(diào)節(jié)，延長(zhǎng)活化后的T淋巴細(xì)胞生存期，使記憶性T淋巴細(xì)胞分化能力增加，還能誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞刺激因子，使B淋巴細(xì)胞受體與免疫球蛋白結(jié)合，最終產(chǎn)生致病的自身抗體[15]。

本研究結(jié)果顯示，PCPA所致失眠大鼠體質(zhì)量下降，出現(xiàn)毛少無(wú)光、易受驚、煩躁易怒、晝夜節(jié)律消失等現(xiàn)象，TLR7、IRF7、IFN-α mRNA表達(dá)水平較高。經(jīng)過(guò)五味子治療后，大鼠體質(zhì)量與空白組大鼠無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），身體狀態(tài)相對(duì)較好，毛發(fā)有光澤，白天安靜倦臥，無(wú)煩躁、易怒等癥狀，同時(shí)TLR7、IRF7 mRNA表達(dá)水平有所降低。五味子可能通過(guò)活化TLR7信號(hào)通路激活免疫，通過(guò)下調(diào)TLR7信號(hào)通路的相關(guān)基因，從而影響免疫因子的釋放，起到改善睡眠作用。本研究?jī)H從基因水平考察五味子改善PCPA致失眠大鼠睡眠情況，后續(xù)研究還應(yīng)從細(xì)胞、蛋白等多角度全面分析五味子通過(guò)影響免疫而改善睡眠的作用機(jī)制。