李榮飛，楊仕品，王愛華，馬紅葉，王天鴻，韋 茜，鐘霈霖，喬 榮

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所/貴州省園藝工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽 550006；2.遵義市農(nóng)業(yè)科學研究院，貴州遵義 563000)

近年來，設(shè)施草莓栽培面積逐年增加，草莓連作障礙發(fā)生越來越嚴重?，F(xiàn)草莓連作障礙不僅在我國普遍存在，在全世界栽培草莓地區(qū)同樣廣泛存在。草莓連作障礙已成為草莓種植者及研究者廣泛關(guān)注的焦點，是急需解決的問題。根據(jù)前人的研究，產(chǎn)生連作障礙的原因主要為土壤養(yǎng)分缺少或失衡[1]，土壤鹽漬化嚴重[2-3]，植物自毒物質(zhì)的分泌[4-5]，土壤微生物變化[6]等。目前，土壤微生物被認為是連作障礙的主要影響因子[7]。土壤微生物是反映土壤肥力和生產(chǎn)力的一個重要指標。一般情況，具有較高的細菌和放線菌數(shù)量的土壤較肥沃，而真菌數(shù)量居多的土壤較貧瘠[8]。連作后土壤微生物變化在黃瓜[9]、韭菜[10]、蘋果[11]等果蔬中均有研究。眾多研究者認為，長期連作會改變根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細菌數(shù)量下降，真菌數(shù)量增多。草莓連作會使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡，影響植株生長[12]。因此，研究者建議生產(chǎn)上應(yīng)盡可能采取措施避免連作，并及時對連作土壤進行修復(fù)改良。

針對大棚草莓連作障礙，現(xiàn)在生產(chǎn)中常用的修復(fù)方法有合理輪作、土壤消毒、生防菌利用、生物炭利用等。合理輪作，不同作物間輪作、擴大草莓種植之間的間距是克服連作障礙最常見的一種防范措施[13-14]，進行大棚草莓—鮮食玉米輪作，經(jīng)濟效益顯著提高[15]。土壤消毒，使用化學藥劑消毒或者高溫(太陽能)消毒，使用化學藥劑進行土壤消毒是目前防治草莓連作病害的主要手段。生防菌利用，利用降解毒素微生物，如細菌菌株 B3512對羥基苯甲酸有降解作用[16]。生物炭利用，生物炭具有作為污染土壤的一種化學鈍化修復(fù)劑的物理化學性質(zhì)，通過吸附、沉淀、離子交換、絡(luò)合等系列反應(yīng)，使污染物向穩(wěn)定化形態(tài)轉(zhuǎn)化，以降低污染物的可遷移性和生物可利用性，達到污染土壤原位修復(fù)的目的[17]。且生物炭可增加土壤微生物的基礎(chǔ)呼吸作用和生物量[18]，從而增強了微生物對有機污染物的降解能力[19]，這可能有利于緩解連作障礙問題。修復(fù)方法較多，但各有其優(yōu)點和不足，少有研究者對多種方法進行比較、篩選。因此，本研究采用輪作、棉隆消毒、生物炭利用、休耕、淋雨等不同調(diào)控措施，通過高通量測序技術(shù)測定根際土壤細菌、真菌群落多樣性和組成，比較不同調(diào)控措施效果，以期為草莓連作障礙調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗在貴州省園藝研究所草莓展示園大棚中進行，試驗種植草莓品種為黔莓1號，于2019年8月下旬移栽。試驗設(shè)置了9個處理和2個對照，分別為處理1(T1)甜玉米輪作(4月下旬至8月上旬種植甜玉米)；處理2(T2)棉隆悶棚(用量為 35 g/m2，參照王廣印等的方法[20])；處理3(T3)小麥秸稈炭；處理4(T4)稻殼炭；處理5(T5)竹炭；處理6(T6)木質(zhì)炭；處理7(T7)菌渣混土(用量 0.9 kg/m2，參照聶勝委等的方法[21])；處理8(T8)未揭棚膜休耕1年；處理9(T9)揭棚膜淋雨1年；對照1(CK1)未處理，對照2(CK2)新土花盆種植。CK2為連作大棚周邊未種植過草莓的土壤，前茬種植葡萄。T3～T6處理為生物炭處理，用量為 10 kg/m2(參照房彬等的方法[22])，T3～T5處理生物炭來源于南京勤豐秸稈科技有限公司。T1～T9處理和CK1，采用隨機區(qū)組處理，每個處理3次重復(fù)(小區(qū))，每個小區(qū) 20 m。CK2設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)20盆，隨機排列。T1～T7處理、CK1、CK2于同一個大棚中，T8、T9處理于相鄰大棚，2個大棚中管理同步。各處理定植前土壤理化性狀見表1。

表1 不同處理定植前土壤理化性狀

1.2 樣品采集

于2020年4月中旬取根際土測微生物群落多樣性。土壤樣本采集按“S”形分別布點，去除表土，采集10～20 cm土層的根系，輕輕抖動根際土壤，每個處理采5個點。同一處理的土壤混合均勻，按四分法處理，將約2 kg的土壤樣品盡快帶回實驗室。將采集的土樣去掉石塊、植物根系、落葉等雜物，用滅菌的 50 mL 離心管裝好，隨即用干冰保存寄到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測定土壤微生物多樣性。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA 抽提和PCR擴增 根據(jù) E.Z.N.A.? soil DNA kit(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)說明書進行微生物群落總DNA 抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，用NanoDrop 2000測定DNA 濃度和純度。使用引物ITS-1F/ITS-2R對真菌rRNA基因ITS可變區(qū)進行 PCR 擴增和引物16S-338F/16S-806R對16S rRNA基因V3～V4 可變區(qū)進行 PCR 擴增。每個樣本3次重復(fù)。

1.3.2 Illumina Miseq 測序 將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后，使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)進行回收產(chǎn)物純化，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，QuantusTMFluorometer(Promega，USA)對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit進行建庫。利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺進行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用上海美吉生信云分析。使用fastp(https：//github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0)軟件對原始測序序列進行質(zhì)控[23]，使用FLASH(http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7)軟件進行拼接[24]。利用RDP classifier(http：//rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)對每條序列進行物種分類注釋[25]，比對真菌ITS數(shù)據(jù)庫和16S rRNA數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理土壤真菌、細菌群落多樣性

2.1.1 真菌群落多樣性 土壤真菌群落通過高通量測序分析，從11個樣品中獲得了857 065個有效序列，并從序列中鑒定出676個操作分類單元(OTU)，被鑒定為 11個門209個屬。從表2可以看出，T1、T2、T4、T8、T9處理群落豐富度高于CK1，且T4處理群落多樣性、均一性、譜系多樣性均高于CK1，但低于CK2。真菌群落豐富度指數(shù)Sobs、Chao、ACE均為T1處理最高，其次是T9處理、CK2，其后依次是T2、T4、T8處理>CK1、T3、T5>T7>T6處理。群落多樣性指數(shù)Shannon以CK2最高，其次是T4處理，T8處理最低。群落均一性Heip、Shannoneven指數(shù)均為CK2最高，且明顯高于其他處理，T4、T6、T7處理高于CK1，T8處理最低。譜系多樣性指數(shù)PD以T9處理最高，T1處理其次，CK2排名第3。表明草莓連作后土壤真菌群落多樣性降低，與對照CK1相比，不同處理后真菌群落多樣性改變，其中T4處理多樣性增加較為明顯，但仍低于未連作的CK2。

表2 不同處理土壤真菌群落多樣性指數(shù)

2.1.2 細菌群落多樣性 土壤細菌群落通過高通量測序分析，從不同處理中獲得了600 340個有效序列，并從序列中鑒定出3 829個OTU，被鑒定為38個門710個屬。由表3可知，CK2土壤細菌群落豐富度、多樣性、均一性、譜系多樣性均明顯低于其他處理，其次是T3、T7處理，之后是CK1、T2、T4處理。細菌群落豐富度指數(shù)Sobs、Chao、ACE均為CK2最低，其次是T7、T3處理，其后依次是T2、T4、CK1、T8、T6、T9處理。群落多樣性指數(shù)Shannon、Simpson為CK2最低，其次是T7、T3處理，之后為T2處理、CK1，T9處理最高。群落均一性Heip、Shannoneven和譜系多樣性指數(shù)均以CK2最低，T3、T7處理其次，之后是CK1、T2、T4處理。

表3 不同處理土壤細菌群落多樣性指數(shù)

2.2 不同處理土壤真菌、細菌群落組成差異

2.2.1 真菌群落組成差異 不同處理土壤真菌群落中子囊菌門占主導(dǎo)地位，CK1、CK2、T1～T9處理中子囊菌門相對豐度分別為96.02%、53.43%、97.66%、98.51%、97.46%、94.01%、96.89%、96.17%、96.50%、99.28%、97.24%。其次是擔子菌門、unclassified_k_Fungi、被孢霉門，CK2中占比最高，分別為20.21%、13.40%、12.84%，T7處理中擔子菌門為3.11%、T4處理中unclassified_k_Fungi為4.53%，低于CK2，但高于其他處理(圖1)。

土壤真菌群落中CK1、T1、T2、T3、T4、T5、T6處理主要真菌屬是unclassified_f_Chaetomiaceae、熱帶頭梗霉屬，但T2、T4處理中以熱帶頭梗霉屬占主導(dǎo)，其他為unclassified_f_Chaetomiaceae占主導(dǎo)(圖2)。CK2中占主導(dǎo)地位的是Apiotrichum(19.86%)、曲霉屬(15.49%)、unclassified_o_Mortierellales(11.22%)、鐮刀菌屬(10.05%)、熱帶頭梗霉屬(6.93%)。T8、T9處理是unclassified_f_Chaetomiaceae占主導(dǎo)，但T9處理真菌群落結(jié)構(gòu)不同于其他處理。CK1、CK2、T1～T9處理中unclassified_f_Chaetomiaceae占比分別為62.78%、2.46%、54.59%、21.77%、61.52%、36.25%、48.36%、55.73%、56.65%、82.51%、46.24%，被孢霉屬占比分別為0.93%、1.62%、0.55%、0.53%、0.93%、1.18%、1.28%、1.22%、0、0、3.22%。表明連作改變土壤真菌結(jié)構(gòu)，種類減少，比例失衡，以少數(shù)菌屬為主。

根據(jù)不同處理土壤真菌OTU分布的Venn圖分析發(fā)現(xiàn)，共有OTU有33種(圖3)，CK2的特異性O(shè)TU最多，有114種，其次是T9處理，而CK1、T6、T7處理最少，僅3種獨有OTU。表明連作減少了土壤中真菌種類和數(shù)量，不同處理方式稍有所改善。

2.2.2 細菌群落組成差異 根據(jù)圖4可知，各處理土壤細菌群落中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、放線細菌門、綠彎菌門、酸桿菌門。土壤細菌群落中厚壁菌門、變形菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、螺旋體菌門均在CK2中占比最高，分別為37.94%、24.44%、14.72%、3.25%、1.04%，但CK2中放線細菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、硝化螺旋菌門、浮霉菌門的相對豐度低于CK1及其他各處理。其中CK1及各處理與CK2差異較大的菌門主要是厚壁菌門、放線細菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門。而各處理間及對照的優(yōu)勢菌門占比不一致，其中T3處理各菌門的占比規(guī)律與CK2較為相近。

根據(jù)圖5可知，各處理細菌群落主要菌屬為芽孢桿菌屬、norank_c_Acidobacteria、norank_o_JG30-KF-CM45、norank_f_Anaerolineaceae、norank_f_Gemmatimonadaceae、微小桿菌、玫瑰彎菌屬、硝化螺菌屬、鏈霉菌屬、類芽孢桿菌屬。CK1、CK2、T1～T9處理中芽孢桿菌屬占比分別為17.88%、20.58%、11.49%、13.09%、19.83%、14.52%、15.04%、16.32%、19.42%、13.27%、8.77%。CK2根際土壤中微小桿菌屬、玫瑰彎菌屬、硝化螺菌屬、鏈霉菌屬、類芽孢桿菌屬占比低于其他處理，分別為1.40%、1.50%、0.30%、0.79%、0.73%，但芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、梭菌屬stricto 13、梭菌屬stricto 12、硫桿菌屬占比最高，分別為20.58%、1.85%、5.81%、1.18%、1.17%。連作改變了土壤細菌群落的組成比例，不同處理間細菌群落組成差異較大，其中T3、T7處理細菌群落的變化規(guī)律與CK2更接近。

據(jù)圖6可知，對照與各處理間共有的OTU 681種，其中CK2特有OTU最多，其次是T9處理。但CK2總的OTU數(shù)最少，T1處理最多。CK1細菌特有OTU共17種，CK2特有OTU主要有22種，稍較CK1多。說明連作后土壤中細菌種類減少，總量增加，這與細菌多樣性分析結(jié)果一致。不同處理稍有不同，其中T7處理細菌總量減少，T9處理細菌種類增加。

2.3 不同處理土壤真菌、細菌群落結(jié)構(gòu)差異

聚類分析樹上不同分枝之間的距離反映了樣本微生物之間遺傳距離的大小。在OTU水平，采用Bray-Curtis距離算法對不同樣本真菌群落相似性分析發(fā)現(xiàn)，CK2與CK1及其他處理間相似度低，差異大，CK1與T6、T3處理相似度高，與T8、T9、T2、T4處理相似度低(圖7-A)。對不同樣本細菌群落相似性分析發(fā)現(xiàn)，CK2與CK1及其他處理間相似度低，差異大，CK1與T1處理相似度高，與T9、T3、T7處理相似度低(圖7-B)。

3 討論

連作會導(dǎo)致植物根際土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)改變，土壤質(zhì)量降低，病害加重，嚴重影響了經(jīng)濟效益。研究發(fā)現(xiàn)，連作后土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)及數(shù)量均會發(fā)生較大的變化[7]。隨連作年限的延長，草莓根際土壤生態(tài)系統(tǒng)中，細菌和真菌群落各門類組成的比例會發(fā)生顯著變化，根際土壤中細菌數(shù)量逐漸降低，真菌數(shù)量逐漸升高，細菌和真菌數(shù)量的比值逐漸降低，導(dǎo)致土壤微生物由“細菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變[26]。在棉花[27]、太子參[28]、蘋果[29]等連作研究中也得出一致的結(jié)論。本研究中，草莓連作后改變了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，種類減少，比例失衡，以少數(shù)菌屬為主；細菌群落多樣性升高，總量增加，種類減少，比例改變。本研究與眾多研究者報道連作后細菌數(shù)量減少、真菌數(shù)量增加的規(guī)律有所差異。但在譚雪蓮等對馬鈴薯連作研究中也發(fā)現(xiàn)，連作3年和5年土壤真菌數(shù)量分別減少了25.68%和 32.43%[30]。在地黃連作研究中發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限的增加，根際真菌減少，放線菌增多[31]。本試驗不同處理后土壤中真菌、細菌群落稍有所改善，其中真菌以稻殼炭(T4)處理效果較為明顯，細菌以秸稈炭(T3)處理和菌渣混土(T7)處理效果較為明顯。

土壤微生物多樣性是指微生物在遺傳、種類和生態(tài)層次上的變化，即微生物群落的穩(wěn)定性，可作為衡量土壤質(zhì)量和評價土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要生物學指標[32-34]。本研究的高通量測序結(jié)果顯示，不同處理根際土壤真菌、細菌群落豐富度、多樣性、均勻度和系譜多樣性等指數(shù)差異明顯。真菌群落中T4處理群落多樣性、均一性、譜系多樣性指數(shù)均高于CK1，但低于CK2。細菌群落中CK2群落豐富度、多樣性、均一性、譜系多樣性均顯著低于其他處理，其次是T3、T7處理，之后是CK1、T2、T4處理，最高的是T9處理。說明草莓連作后土壤真菌群落多樣性降低，與CK1相比，不同處理后真菌群落有所改善，其中稻殼炭(T4)處理效果較為明顯。由于稻殼炭結(jié)構(gòu)疏松、多孔，容重低，施用稻殼炭于土壤后，土壤表面的理化性質(zhì)會隨時間而發(fā)生變化，且使土壤微生物生物量增加[35]，故稻殼炭處理效果較好于其他處理。生產(chǎn)上可混合施用稻殼炭、秸稈炭修復(fù)草莓連作大棚土壤。

本試驗各處理真菌群落中子囊菌門占主導(dǎo)地位，其次是擔子菌門、unclassified_k_Fungi、被孢霉門，其中CK2子囊菌門最低，其他優(yōu)勢菌門均較高于CK1、T1～T9處理。CK1、T1～T6處理主要真菌屬是unclassified_f_Chaetomiaceae、熱帶頭梗霉屬，其中T2、T4處理中熱帶頭梗霉屬占主導(dǎo)，CK2中占主導(dǎo)地位的是Apiotrichum、曲霉屬、unclassified_o_Mortierellales、鐮刀菌屬、熱帶頭梗霉屬。王曉寶等研究發(fā)現(xiàn)，被孢霉屬的相對豐度與蘋果連作障礙的嚴重程度呈顯著性負相關(guān)，對植株的生長起促進作用[11]。本研究CK2中以曲霉屬、unclassified_o_Mortierellales、鐮刀菌屬為優(yōu)勢菌屬，被孢霉屬占比最高，表明連作后土壤中有益真菌相對含量減少，將影響植株生長發(fā)育。本研究對不同樣本真菌群落相似性分析發(fā)現(xiàn)，CK2與CK1及其他處理間相似度低、差異大，CK1與T6、T3處理相似度高，與T8、T9、T2、T4處理相似度低。表明連作前后真菌群落結(jié)構(gòu)差異大，修復(fù)之后各處理間差異明顯，但與未連作處理仍存在較大差異，需要進一步修復(fù)調(diào)控。

本試驗各處理土壤細菌群落中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、放線細菌門、綠彎菌門、酸桿菌門，主要菌屬為芽孢桿菌、微小桿菌、玫瑰彎菌屬、硝化螺菌屬、鏈霉菌屬、類芽孢桿菌屬等。CK1及各處理與CK2差異較大的菌門主要是厚壁菌門、放線細菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門。厚壁菌門中芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌在碳水化合物代謝中起著重要作用[36]。擬桿菌門細菌與有機物的吸收、利用關(guān)系密切，能夠降解聚合物，是環(huán)境中碳循環(huán)的重要參與者[37]。變形菌、浮霉菌、放線菌等被認為是富營養(yǎng)菌[38]。綠彎菌門細菌傾向于生活在營養(yǎng)充足的環(huán)境中，大量的營養(yǎng)元素有利于其生長繁殖[39]。酸桿菌門細菌適合在有機碳含量低的酸性土壤中生存[40]。本研究中未連作的CK2中厚壁菌門、綠彎菌門、擬桿菌門占比高，而放線菌門、酸桿菌門和浮霉菌門占比少，說明連作之后土壤細菌群落改變，分解型細菌減少，富營養(yǎng)型細菌增加，連作土壤肥力營養(yǎng)充足，土壤酸性降低。芽孢桿菌屬的很多菌都是有利于植物生長發(fā)育的促生菌，如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌等[41]，本研究中未連作的CK2中芽孢桿菌屬相對含量最高，其次是T3、T7處理，說明連作之后土壤中有益細菌含量減少。大棚草莓連作后改變了土壤細菌群落的組成比例，不同調(diào)控處理后土壤中細菌群落組成差異較大，其中秸稈炭(T3)處理和菌渣混土(T7)處理變化規(guī)律與CK2更接近，這與不同樣本細菌群落相似性分析結(jié)果相吻合。

4 結(jié)論

(1)真菌群落中稻殼炭處理群落多樣性、均一性、譜系多樣性指數(shù)均高于CK1，但低于CK2。與對照CK1相比，不同處理后真菌群落有所改善，其中稻殼炭(T4)處理效果較為明顯。(2)細菌群落中CK2群落豐富度、多樣性、均一性、譜系多樣性均明顯低于其他處理，其次是T3、T7處理，其中秸稈炭(T3)處理優(yōu)勢菌門占比規(guī)律與CK2較為相似。(3)真菌群落CK1與T6、T3處理相似度高，與T8、T9、T2、T4處理相似度低。細菌群落CK1與T1處理相似度高，與T9、T3、T7處理相似度低。不同處理對草莓連作大棚土壤真菌、細菌群落稍有所改善，其中真菌以施稻殼炭效果較為明顯，細菌以施秸稈炭和菌渣混土效果較為明顯，生產(chǎn)上可混合施用稻殼炭、秸稈炭修復(fù)草莓連作大棚土壤。