林群英，龔光祿，李傳華，吳亮亮，鄧春英

(1.中華全國(guó)供銷合作總社南京野生植物綜合利用研究所，江蘇南京 211100；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/貴州省食用菌育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550006；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403；4.貴州科學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550001)

蟲草類真菌因其獨(dú)特的生活史而備受關(guān)注，而顯著的藥理活性則大大促進(jìn)其應(yīng)用開發(fā)。近20年來(lái)，蟲草類文獻(xiàn)有2 000余篇[1]，蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)人工培養(yǎng)基質(zhì)相關(guān)專利申請(qǐng)數(shù)為377件[2]。除了冬蟲夏草(Ophiocordycepssinensis)和蛹蟲草外，廣東蟲草(Tolypocladiumguangdongense)和蟬花(C.chanhua)等更多種類開始得到廣泛應(yīng)用[3-4]。新古尼異蟲草(Metacordycepsneogunnii)的外觀與冬蟲夏草十分相似，常被混淆或作為替代品使用，該種具有多種與冬蟲夏草相似的藥理活性，如抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)傷口愈合等多種活性作用[5-6]。新古尼異蟲草在我國(guó)一直被認(rèn)為是古尼蟲草(C.gunnii)，直至2017年才被重新鑒定為新種，且兩者在遺傳上有很大的差異[7]。

盡管新古尼異蟲草具有突出的應(yīng)用價(jià)值，但由于未能實(shí)現(xiàn)規(guī)模化商業(yè)栽培，目前僅能使用野生資源，這極大限制了其開發(fā)利用。新古尼異蟲草人工培養(yǎng)始于1985年，當(dāng)時(shí)報(bào)道新古尼異蟲草的無(wú)性型及平板菌絲培養(yǎng)情況[8-9]。1990年，劉杰麟等首次報(bào)道新古尼異蟲草子實(shí)體的馴化栽培，在米飯培養(yǎng)基上長(zhǎng)出少量子實(shí)體，生長(zhǎng)周期為3個(gè)月[10]，直至2015年，孫超男證實(shí)小米最利于古尼蟲草子實(shí)體的生長(zhǎng)，產(chǎn)量較前者略有提高，但離生產(chǎn)要求仍有較大差距[11]。新古尼異蟲草子實(shí)體栽培的研究進(jìn)展很緩慢，可見其難度較大。盡管人工培養(yǎng)子實(shí)體的難度較大，但這一培養(yǎng)方式的產(chǎn)品與長(zhǎng)久以來(lái)的使用習(xí)慣最為接近，因此，實(shí)現(xiàn)其人工培養(yǎng)是解決資源可持續(xù)利用的有力途徑。本研究以分離于野生子實(shí)體的菌株為研究對(duì)象，對(duì)其生物學(xué)特性及產(chǎn)子實(shí)體能力進(jìn)行研究，并對(duì)子實(shí)體成分進(jìn)行分析，以期為該種人工栽培提供更多種質(zhì)資源和參考依據(jù)，加快實(shí)現(xiàn)新古尼異蟲草子實(shí)體的規(guī)?；斯ぴ耘?。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種分離

以采集自貴州省黔東南苗族侗族自治州施秉縣的一批野生新古尼異蟲草為材料，采用組織分離的方法進(jìn)行菌種分離，將子實(shí)體和菌核中菌肉組織置于PPDA培養(yǎng)基，20 ℃下暗培養(yǎng)10～20 d。分離所得的菌種均經(jīng)純化，確保無(wú)雜菌污染。經(jīng)初步篩選，獲得1株可產(chǎn)生墨綠色素的菌種，編號(hào)為：2020031916。由圖1可知，初步確定為新古尼異蟲草的無(wú)性型；進(jìn)行ITS序列測(cè)序，序列提交至GenBank，編號(hào)為OM967169。經(jīng)對(duì)比，最終確定為新古尼異蟲草(Metacordycepsneogunnii)。菌種經(jīng)轉(zhuǎn)管擴(kuò)繁，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)(CCTCC No.)：M2021416。

1.2 生物學(xué)特性分析

1.2.1 碳源對(duì)新古尼異蟲草菌絲生長(zhǎng)的影響 將6種碳源分別添加至對(duì)照組培養(yǎng)基(蛋白胨4 g/L，牛肉浸膏4 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，維生素B10.05 g/L，瓊脂20 g/L，pH值為6.5，CK-C)中，用量為20 g/L。115 ℃滅菌 30 min，配制成平板培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中心接種1個(gè)直徑5 mm的圓形菌塊，培養(yǎng)溫度25 ℃，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。采用十字劃線法測(cè)量菌落半徑計(jì)算菌絲日均生長(zhǎng)速度，每隔5 d標(biāo)記1次菌落半徑，培養(yǎng)15 d后測(cè)量菌落半徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度。

1.2.2 氮源對(duì)新古尼異蟲草菌絲生長(zhǎng)的影響 將11種氮源分別添加至對(duì)照培養(yǎng)基(葡萄糖20 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，維生素B10.05 g/L，瓊脂20 g/L，pH值為6.5，CK-N)中，用量為8 g/L。余下步驟同“1.2.1”節(jié)，各組設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.3 溫度對(duì)新古尼異蟲草菌絲生長(zhǎng)的影響 將菌塊接至PDA平板上，分別置于15、20、25 ℃下，避光培養(yǎng)，設(shè)3個(gè)平行。余下步驟同“1.2.1”節(jié)。

1.2.4 pH值對(duì)新古尼異蟲草菌絲生長(zhǎng)的影響 PDA培養(yǎng)基滅菌后用無(wú)菌的0.1 mol/L HCl和 0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，再將菌塊分別接至不同pH值的平板上，20 ℃下避光培養(yǎng)，設(shè)3個(gè)重復(fù)。余下步驟同“1.2.1”節(jié)。

1.3 新古尼異蟲草出草試驗(yàn)

新古尼異蟲草按照以下方法進(jìn)行出草試驗(yàn)：斜面菌種接入液體培養(yǎng)基(葡萄糖20 g/L，蛋白胨 8 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，維生素B10.02 g/L)，20 ℃下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)5 d，轉(zhuǎn)速為 160 r/min。將液體菌種按10 mL/瓶的接種量接入小米培養(yǎng)基。每個(gè)栽培瓶含25 g小米、0.5 g蠶蛹粉和45 mL營(yíng)養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)液配方為：果糖20 g，酵母浸膏1 g，維生素B10.02 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，水定容至1 L。20 ℃下暗培養(yǎng)8 d，至菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基，開始產(chǎn)生墨綠色色素時(shí)，開始轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)階段。光照度為800 lx，光照時(shí)間 12 h/d，溫度為18 ℃，加強(qiáng)通風(fēng)，通風(fēng)時(shí)間為 0.5 h/次，2 次/d。繼續(xù)培養(yǎng)至子實(shí)體頂端略膨大，即可采收。60 ℃烘干子實(shí)體。

1.4 人工栽培的子實(shí)體成分分析

子實(shí)體中粗蛋白的含量按照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中第一法測(cè)定，換算系數(shù)為6.25；粗纖維含量按照GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維》測(cè)定；總灰分含量按照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分》測(cè)定；水解氨基酸含量按照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸》測(cè)定；微量元素按照GB 5009.268—2016第二法進(jìn)行測(cè)定；重金屬砷、鎘和鉛含量按照GB 5009.268—2016第一法進(jìn)行測(cè)定，汞按照GB 5009.17—2014第一篇第一法進(jìn)行測(cè)定；蟲草酸用高效液體色譜法[12]測(cè)定、蟲草素和腺苷含量按 NY/T 2116—2012中的方法測(cè)定；粗多糖含量按照 NY/T 1676—2008中的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0(SPSS Inc，Chicago，IL)軟件進(jìn)行處理，通過(guò)一維方差分析(analysis of variance，ANOVA)最小顯著差法(least significant difference，LSD，α=0.05)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)新古尼異蟲草菌絲體生長(zhǎng)的影響

新古尼異蟲草在不同碳源固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)差異較為明顯。由圖1-b和圖2可知，果糖為碳源時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，菌絲生長(zhǎng)速度為1.5 mm/d，菌絲粗壯、濃密、潔白；其次是麥芽糖和玉米淀粉，這2種碳源的培養(yǎng)基上菌絲濃密，但生長(zhǎng)速度略慢；蔗糖和甘油為碳源時(shí)菌絲生長(zhǎng)較慢，且菌絲長(zhǎng)勢(shì)一般；對(duì)照組培養(yǎng)基的菌絲生長(zhǎng)速度最慢，僅0.9 mm/d。

2.2 氮源對(duì)新古尼異蟲草菌絲體生長(zhǎng)的影響

利用不同氮源培養(yǎng)新古尼異蟲草時(shí)，菌絲的生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)均有差異。由圖3可知，蠶蛹水提物為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度快，1.5 mm/d，菌絲粗壯、濃密、潔白，其次是棉籽蛋白，且兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；胰蛋白胨和蛋白胨為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度相同，略低于蠶蛹水提物，為1.4 mm/d；硫酸銨為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)受到抑制，遠(yuǎn)低于對(duì)照組。

2.3 溫度對(duì)新古尼異蟲草菌絲體生長(zhǎng)的影響

由圖4可知，新古尼異蟲草菌株20200309016最佳的生長(zhǎng)溫度為25 ℃，其次是20 ℃，生長(zhǎng)速度分別為1.1、1.0 mm/d，在15 ℃低溫條件下，菌絲的生長(zhǎng)速度大大降低，僅為0.6 mm/d，比20 ℃下降了40%?？梢娫摼陮?duì)溫度較為敏感。

2.4 pH值對(duì)新古尼異蟲草菌絲體生長(zhǎng)的影響

由圖5可知，弱酸性環(huán)境最利于新古尼異蟲草菌絲的生長(zhǎng)，以pH值為5.0最佳，生長(zhǎng)速度達(dá) 1.2 mm/d，pH值為8.0～9.0堿性條件不利于菌絲的生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)緩慢且稀疏。

2.5 子實(shí)體人工栽培

小米培養(yǎng)基為主要原料栽培新古尼異蟲草的效果良好，菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面需時(shí)4～5 d，菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)料需時(shí)8 d。光照培養(yǎng)后，菌絲產(chǎn)生明顯的墨綠色素，而表面的氣生菌絲仍以白色為主，色素不明顯。由圖6可知，光照10 d后，原基開始形成，呈圓形。自原基形成起，子實(shí)體生長(zhǎng)至成熟，需時(shí) 40～50 d。成熟時(shí)，子實(shí)體頂端略膨大，部分會(huì)呈暗綠色。子實(shí)體最高可達(dá)6 cm，產(chǎn)量最高可達(dá) 9.5 g/瓶，生物轉(zhuǎn)化率為47.5%，平均產(chǎn)量6.22 g/瓶，生物轉(zhuǎn)化率為31%。

2.6 人工栽培的子實(shí)體成分分析

2.6.1 常規(guī)成分 人工栽培的新古尼異蟲草子實(shí)體干品含粗蛋白質(zhì)29.5%(按轉(zhuǎn)換系數(shù)6.25計(jì)算)。含粗纖維20.4%，灰分4.02%。

2.6.2 水解氨基酸 由表1可知，子實(shí)體和培養(yǎng)殘基均含有16種水解氨基酸，總含量分別為14.30%和7.06%。子實(shí)體含谷氨酸含量最高，為2.37%，其次是天冬氨酸和丙氨酸，為1.56%和1.12%。培養(yǎng)殘基的谷氨酸含量最高，為1.28%，其次是丙氨酸，為0.69%。由于培養(yǎng)殘基中菌絲的生物量遠(yuǎn)低于子實(shí)體，因此兩者水解氨基酸含量差異很大。

表1 新古尼異蟲草子實(shí)體水解氨基酸的含量

2.6.3 微量元素及重金屬 由表2可知，新古尼異蟲草子實(shí)體中錳、鐵、銅、鋅和鈣等5種微量元素的含量分別是9.13、21.50、2.69、85.20、223.00 mg/kg。同時(shí)，還對(duì)4種重金屬進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，砷和鎘含量分別為0.067 6、0.044 1 mg/kg，鉛、汞均未檢出。這4種重金屬的含量符合GB 2762—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》要求。

表2 新古尼異蟲草微量元素和重金屬的含量

2.6.4 有效成分 新古尼異蟲草人工栽培的子實(shí)體含腺苷0.049 7%、蟲草酸7.8%、多糖5.5%，但未檢測(cè)到蟲草素。

3 討論

新古尼異蟲草在我國(guó)的研究歷史已有30余年，主要集中在藥理活性、成分分析和液體培養(yǎng)等方面。人工馴化和子實(shí)體栽培方面的研究少，主要是由于難度較大所致。本研究以自行分離獲得的菌株進(jìn)行生物學(xué)特性及人工栽培研究，成功獲得栽培性狀優(yōu)良的子實(shí)體。由于新古尼異蟲草存在內(nèi)菌核多菌定殖現(xiàn)象，所以菌株的真實(shí)性有必要經(jīng)分子及形態(tài)鑒定以保證研究的有效性[13-14]。

新古尼異蟲草無(wú)性型在菌落形態(tài)、菌絲體活性成分等方面存在較大差異。本研究所用的菌株在液體培養(yǎng)時(shí)菌絲形態(tài)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)較大差別。賈學(xué)淵等[15]和蔣嵐等[16]均證實(shí)菌株類型與活性成分含量有極大的相關(guān)性。本研究所采用的菌株2020031916菌落最顯著的特點(diǎn)是產(chǎn)墨綠色色素，與已報(bào)道的菌株[15-16]相同。但此菌株生長(zhǎng)速度慢，僅1.2 mm/d，比孟祥賢等報(bào)道的4.0～5.5 mm/d[17]慢。在pH值方面，此菌株偏好弱酸性條件，與菌株5-19[18]不同。營(yíng)養(yǎng)條件方面，果糖和蠶蛹水提物最利于菌株2020031916菌絲的生長(zhǎng)，而菌株 5-19則以葡萄糖和尿素為最佳的碳氮源[19]。劉曉翠等證實(shí)，可溶性淀粉和蛋白胨最利于菌絲體的生長(zhǎng)[20]，這極可能是由于研究采用的菌株和所測(cè)試的碳氮源的范圍不同所致。

新古尼異蟲草菌株2020031916具有優(yōu)良的出草能力，最高產(chǎn)量可達(dá)9.5 g/瓶，生物轉(zhuǎn)化率為47.5%，遠(yuǎn)高于目前已有的報(bào)道。劉杰麟等采用 5-19-M菌株，以覆蓋松針等方法栽培獲得子實(shí)體9個(gè)/瓶，在栽培瓶中獲得的子實(shí)體長(zhǎng)度為 7 cm[10]。而孫超男采用的單孢菌株S21獲得子實(shí)體，產(chǎn)量為2.46 g/瓶，子實(shí)體平均高度為3.02 cm[11]。雖然本研究取得了較前人更好的進(jìn)展，但離生產(chǎn)應(yīng)用仍有很大距離。為更好地實(shí)現(xiàn)人工栽培，Long等已對(duì)新古尼異蟲草的基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序分析[21]，以獲得關(guān)鍵遺傳信息用于菌株篩選和生理調(diào)控。

人工栽培獲得的新古尼異蟲草子實(shí)體富含多種營(yíng)養(yǎng)和活性物質(zhì)。子實(shí)體粗蛋白含量較高，接近30%，高于蛹蟲草、冬蟲夏草和廣東蟲草，而粗纖維同樣高于這些種類[22]。水解氨基酸則與這些種類相近。人工栽培的子實(shí)體未檢測(cè)出蟲草素，這結(jié)果與武為寶等的結(jié)果[32]一致，但與液體培養(yǎng)的菌絲體中的檢測(cè)結(jié)果[15-16]不一致。新古尼異蟲草中蟲草酸和粗多糖的含量與常規(guī)條件下栽培的蛹蟲草子實(shí)體[24]相近。基于這些主要營(yíng)養(yǎng)及活性成分的比較分析，可推測(cè)人工栽培的新古尼異蟲草子實(shí)體具有食品新資源原料和保健食品的開發(fā)潛力。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)菌株2020031916進(jìn)行生物學(xué)特性及人工栽培研究，成功實(shí)現(xiàn)性狀優(yōu)良的子實(shí)體人工栽培，部分營(yíng)養(yǎng)及活性成分高于當(dāng)前已規(guī)模化栽培的蟲草種類或與之相近。果糖和蠶蛹水提液最利于菌絲體的生長(zhǎng)；25 ℃、pH值為5.0時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)最快。新古尼異蟲草子實(shí)體最高可達(dá)6 cm，生物轉(zhuǎn)化率最高達(dá)47.50%。子實(shí)體含粗蛋白29.50%、粗纖維20.40%、灰分4.02%、水解氨基酸14.30%；有效成分方面，含腺苷497 mg/kg、粗多糖5.50%、蟲草酸7.00%。本研究為新古尼異蟲草的人工栽培提供了優(yōu)良的種質(zhì)資源，將有助于加快實(shí)現(xiàn)該種類的子實(shí)體規(guī)?；斯ぴ耘?。