閆建英，李虎，邢瀟月，劉祥杰，梁成孔，張家浩*

（1.和田地區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 新疆和田 848000；2.塔里木大學動物科學與技術(shù)學院 新疆阿拉爾 843300；3.塔里木畜牧科技兵團重點實驗室 新疆阿拉爾 843300；4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室 新疆阿拉爾 843300）

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）是腸桿菌科變形桿菌屬，是一種革蘭氏陰性條件致病菌[1]。該菌在自然界分布極廣，不僅可以在人和動物體內(nèi)生存[2]，也可存在于土壤和污水等環(huán)境中。該菌可感染宿主種類多樣，能感染豬、牛和羊等常見養(yǎng)殖動物，也有文獻報道在水貂、狐貍和蛇等動物中分離到該菌[3]。近年來雞感染奇異變形桿菌的報道較多[4-7]，給雞養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。

隨著抗生素的濫用，奇異變形桿菌的耐藥性逐漸增強，對禽類疾病的治療與預(yù)防造成了極大的困難。賈沅錚[4]等分離的52 株奇異變形桿菌對紅霉素等5 種抗生素100%耐藥；對環(huán)丙沙星等9 種抗生素耐藥性均高于50%。徐睿[5]等分離的2 株奇異變形桿菌耐藥率分別為78.6%（11/14）和71.44%（10/14）。

本試驗無菌采集新疆阿克蘇地區(qū)某雞場病雞病料，進行病原檢測和細菌的分離培養(yǎng)，通過形態(tài)學觀察、生化試驗和16S rRNA序列分析進行鑒定，同時研究其耐藥性和致病性，為防控奇異變形桿菌在雞群中的傳播提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 樣品來源

2022 年7 月，新疆阿克蘇地區(qū)某雞場雛雞出現(xiàn)腹瀉、消瘦、擠作一團；剖檢病變主要為肝臟、脾臟等器官出現(xiàn)不同程度的腫大。為確定致雞群發(fā)病的病原，采集病死雞病料置于無菌自封袋中帶回實驗室診斷。

1.2 試驗動物

15 只3 日齡雛雞，購自塔里木大學動物試驗中心。

1.3 試驗方法

1）分離和純化。用高壓滅菌棉拭子蘸取肝臟內(nèi)部細菌接種于BHI 固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h，挑取單菌落劃線接種于SS 瓊脂固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h 后，取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，觀察細菌形態(tài)及染色特性。

2）生化鑒定。將分離株的純培養(yǎng)物分別接種于細菌微量生化反應(yīng)管中37℃培養(yǎng)24h，觀察試驗結(jié)果。

3）16S rRNA 基因的擴增。參照文獻[4]合成細菌16S rRNA 基因通用引物，預(yù)期擴增產(chǎn)物長度約為1,465bp。用細菌基因組提取試劑盒提取分離菌株的DNA 進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系：模板1μL，EasyTaq SuperMix 12.5μL，上、下游引物各0.5μL，滅菌雙蒸水補齊至25μL。PCR 擴增程序為：94℃300s；94℃30s，56℃30s，72℃90s，72℃600s，35 個循環(huán)。將經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的PCR 產(chǎn)物送至上海生工測序，對所測序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行比對，使用DNA star 對所測的菌株做進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建及相似性分析。

4）藥物敏感性試驗。按照紙片瓊脂擴散法，對分離菌株進行藥物敏感性試驗。將17 種所測藥敏片平鋪在平板表面，37℃培養(yǎng)24h，測量抑菌圈直徑，判斷分離菌的耐藥性。

5）動物回歸試驗。挑取培養(yǎng)單個菌落在BHI 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至濃度達到3×108cfu/mL。動物分組：將15 只3 日齡雛雞隨機分為3 組，每組5 只。第1、2 組為試驗組，第3 組為對照組。第1 組腹腔注射0.5mL 含3×108cfu/mL 的菌液，第2 組腹腔注射0.5mL 含3×107cfu/mL 的菌液，第3 組為空白對照組，不作任何處理。每日觀察、記錄試驗雛雞情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果

37℃培養(yǎng)24～48h 后，在SS 瓊脂固體培養(yǎng)基上生長出中心黑色，周圍白色或橘色的圓形菌落；在BHI 固體培養(yǎng)基上生長出表面光滑，邊緣整齊的無色透明菌落。

2.2 革蘭染色結(jié)果

菌體呈桿狀或短桿狀、革蘭染色陰性、大小均勻、兩端鈍圓、多為散在排列（見圖1）

圖1 分離菌株革蘭染色鏡檢結(jié)果圖（10×100）

2.3 生化鑒定結(jié)果

試驗結(jié)果顯示，分離菌不發(fā)酵麥芽糖、蔗糖、乳糖，甘露醇、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、氧化酶試驗顯示陰性；分離菌發(fā)酵木糖、葡萄糖、覃糖，山梨醇、尿素分解、枸櫞酸鹽試驗為陽性。參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第8 版)[8]確定分離菌符合奇異變形桿菌的生化特性。

2.4 16S rRNA 擴增結(jié)果

將PCR 擴增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示擴增條帶約為1,400bp 左右，與預(yù)計大小相同。將分離菌株分別命名為X001。

2.5 16S rRNA 序列比對結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

由圖1 可知，分離菌株S001 與登錄號為KC456549、OL629184、OL629187、OL629213、OL629209、OL629230、ON460264、ON329112 等的奇異變形桿菌處于同一分支，將登錄號為ON000821 的枯草芽孢桿菌作為外圍支（見圖2）。

由圖2 同源性分析表可知，菌株X001 與8 株奇異變形桿菌參考株同源性均高于99.9%，與登錄號為ON000821 的枯草芽孢桿菌同源性為78.2%。結(jié)合分離菌的形態(tài)、生理生化特征和序列比對結(jié)果，將菌株X001 鑒定為奇異變形桿菌。同源性分析（見圖3）。

圖2 系統(tǒng)進化樹

圖3 同源性分析

2.6 藥物敏感性試驗結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示：分離菌對復(fù)方磺胺甲噁唑表現(xiàn)為中介、對慶大霉素和丁胺卡那表現(xiàn)為敏感，對其他5 種抗生素表現(xiàn)為耐藥。試驗結(jié)果見表1。

表1 分離菌株的藥物敏感性試驗結(jié)果

2.7 動物回歸試驗

攻毒后12h，第1 組雛雞死亡2 只，試驗組其他雛雞出現(xiàn)臨床癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡、食欲減退、縮頸閉目、畏冷、擠作一團、排白色糞便；接種24h 后，第1 組雛雞全部死亡。對死亡雛雞剖檢可見肝臟輕微腫大、表面淤血，脾臟、腎臟有不同程度的腫大。第2 組雛雞至試驗結(jié)束未發(fā)生死亡。第3 組雛雞至試驗結(jié)束較接種前無變化，各組織器官均未分離出細菌。將試驗組死亡雛雞肝臟等組織進行細菌分離培養(yǎng)，菌落形態(tài)、革蘭染色和生化試驗結(jié)果與原分離菌一致，16S rRNA 檢測結(jié)果也顯示分離出的細菌為奇異變形桿菌。

3 討論

在科學技術(shù)和經(jīng)濟快速發(fā)展的時代下，抗生素被廣泛用于動物的感染性疾病和保健品，導(dǎo)致奇異變形桿菌的耐藥性逐漸增強，甚至出現(xiàn)了多重耐藥，使本病的防治十分棘手。本研究中，分離菌X001 表現(xiàn)多重耐藥，以往的研究中也有類似結(jié)果[4-7]。藥敏試驗表明，分離菌X001 對復(fù)方磺胺甲噁唑表現(xiàn)為中介、對慶大霉素和丁胺卡那表現(xiàn)為敏感，對其他幾種抗生素表現(xiàn)為耐藥。結(jié)合以往研究可知，國內(nèi)禽源奇異變形桿菌對常用抗生素的耐藥情況較為嚴重，對藥物的敏感性越來越低，耐藥譜不斷擴大。因此臨床用藥時，一定要先做藥物敏感性試驗，根據(jù)試驗結(jié)果來選擇治療藥物。此外，在養(yǎng)殖過程中要對奇異變形桿菌感染引起足夠的重視，在平時的飼養(yǎng)中要注意加強飼養(yǎng)管理，提高養(yǎng)殖動物的免疫力，堅持防大于治的原則，在治療中要合理用藥。

雛雞回歸試驗表明該分離菌可引起雛雞精神萎靡、食欲減退并造成死亡，有較強的致病性，由于該菌是人畜共患病原菌，因此相關(guān)的蛋肉產(chǎn)品可能會對食品安全構(gòu)成威脅。試驗雛雞癥狀和剖檢病變與雞場發(fā)病雞相同，表明奇異變形桿菌是該雞場雛雞發(fā)病、死亡的致病菌。在本病例中，筆者根據(jù)藥敏試驗結(jié)果使用慶大霉素進行治療，用藥后雞場病雞臨床癥狀消失，死亡率下降。

我國社會經(jīng)濟的快速發(fā)展雖然推動著家禽養(yǎng)殖行業(yè)的向前邁進，但因為巨大的市場競爭力和飼養(yǎng)周期的縮短使雞群的免疫力逐漸地降低，尤其是雛雞的奇異變形桿感染率增加，這對于食用性動物源產(chǎn)品是一種潛在的巨大的危害。因此，需要對該地區(qū)雞場提供可行性的建議，首先要合理規(guī)范的使用抗菌藥，以降低耐藥性、減少多重耐藥菌株的出現(xiàn)。與此同時，需要提高動物的飼養(yǎng)技術(shù)和管理模式，對圈舍以及養(yǎng)殖環(huán)境制定一個合理規(guī)范的清潔消毒計劃，堅持自繁自養(yǎng)，全進全出，防患于未然。

4 結(jié)論

本試驗從新疆阿克蘇地區(qū)某雞場病雞體內(nèi)分離到1 株細菌，經(jīng)細菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學觀察、生化鑒定和16S rRNA 序列鑒定，確定分離菌為奇異變形桿菌。確診引起該雞場雛雞發(fā)病、死亡數(shù)量增加的病因為奇異變形桿菌感染，表明新疆阿克蘇地區(qū)雞群中存在奇異變形桿菌感染，應(yīng)進一步改善雞場飼養(yǎng)管理模式并加強禽類食品的安全衛(wèi)生檢測工作。藥敏試驗表明分離菌具有多重耐藥性，應(yīng)加強對奇異變形桿菌耐藥性的檢測。本研究為該病的防治和臨床合理用藥提供了科學依據(jù)?！?/p>