李云蕊,劉俊杰,艾明雄,孫顯國(guó)

(1.云南省楚雄彝族自治州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，云南 楚雄 675000;2.昆明正大豬業(yè)有限公司，云南 昆明 650000)

工業(yè)生產(chǎn)排放的汞離子(Hg2+)直接破壞自然環(huán)境，且通過(guò)食物鏈進(jìn)行生物累積進(jìn)一步威脅公眾健康。Hg2+對(duì)蛋白質(zhì)和酶中的硫醇基具有高親和性，即使極低劑量的接觸也可能導(dǎo)致認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)障礙，增大心血管疾病，甚至癌癥的發(fā)生幾率[1-3]。因此，在低濃度下對(duì)Hg2+進(jìn)行靈敏檢測(cè)對(duì)于環(huán)境保護(hù)和疾病預(yù)防都具有重要意義。Hg2+常見(jiàn)的檢測(cè)技術(shù)包括原子吸收光譜法[4]、原子熒光光譜法[5]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[6]、X射線吸收光譜法[7]。然而這些技術(shù)不僅需要大型專(zhuān)業(yè)儀器和訓(xùn)練有素的工作人員，而且存在繁瑣、耗時(shí)、不適合便攜式使用、無(wú)法現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等局限。因此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏、選擇性監(jiān)測(cè)Hg2+的高效分析方法的非常必要。

與傳統(tǒng)分析技術(shù)相比，電化學(xué)生物傳感器在便攜性、低成本、簡(jiǎn)單性、選擇性、靈敏度方面更具優(yōu)勢(shì)[8]。近年來(lái)，研究人員在構(gòu)建新型Hg2+電化學(xué)生物傳感器方面做出了許多貢獻(xiàn)。特別是，隨著DNA納米技術(shù)的發(fā)展，將新型DNA納米機(jī)器和多種核酸信號(hào)放大策略集成到電化學(xué)生物傳感器的開(kāi)發(fā)研究中，對(duì)Hg2+檢測(cè)的特異性?xún)?yōu)化、靈敏度提升具有重要意義[9-11]。本文闡述了近年來(lái)構(gòu)建的Hg2+電化學(xué)生物傳感器的研究進(jìn)展，主要包括簡(jiǎn)單的Hg2+電化學(xué)生物傳感器、核酸信號(hào)放大策略對(duì)Hg2+檢測(cè)靈敏度的提升，以及納米機(jī)器在Hg2+電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用。

1 簡(jiǎn)單的Hg2+電化學(xué)生物傳感器

1.1 電化學(xué)生物傳感器原理

電化學(xué)生物傳感器主要包括生物識(shí)別元件、信號(hào)轉(zhuǎn)換器、數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)三部分(圖1)。當(dāng)生物識(shí)別元件與目標(biāo)分析物特異性結(jié)合時(shí)，其相互作用經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為電流、累積電荷、阻抗或電位的變化，數(shù)據(jù)分析處理后即可輸出與分析物濃度相關(guān)的電信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物的定量檢測(cè)[12]。針對(duì)不同的檢測(cè)需求，全細(xì)胞、組織、酶、抗體、適配體、DNA等均可作為生物識(shí)別元件，使得電化學(xué)生物傳感器在疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品質(zhì)量管理等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[13-15]。

圖1 電化學(xué)生物傳感器示意圖

1.2 T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)

寡核苷酸是一種高效、環(huán)保,具有生物特異性的分析工具。一些重金屬離子對(duì)某些DNA堿基具有選擇性，可通過(guò)配位鍵形成穩(wěn)定的堿基對(duì)。2004年，Ono和Togashi[16]首次報(bào)道了當(dāng)Hg2+存在時(shí)，包含胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(T-T)錯(cuò)配堿基對(duì)的DNA雙鏈呈現(xiàn)較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性,而其他重金屬離子，如Cu2+、Ni2+、Pd2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Pb2+等，對(duì)T-T錯(cuò)配DNA雙鏈的熱穩(wěn)定性并無(wú)顯著增強(qiáng)。經(jīng)核磁共振實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了Hg2+易與T-T堿基對(duì)特異性結(jié)合形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，其結(jié)合的相互作用力甚至高于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的T-A沃森-克里克堿基對(duì)[17-18]。因此，依賴(lài)于Hg2+與T-T錯(cuò)配堿基的特異性結(jié)合可以設(shè)計(jì)高選擇性的Hg2+電化學(xué)生物傳感器。

1.3 基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)構(gòu)建的簡(jiǎn)單電化學(xué)生物傳感器

如圖2所示，Wu等[19]人通過(guò)自組裝將富T堿基的DNA單鏈固載在金電極上，利用Hg2+和T堿基之間的特異性結(jié)合作用來(lái)選擇性地將Hg2+捕獲于電極表面，并采用差分脈沖伏安法對(duì)Hg2+進(jìn)行測(cè)定，開(kāi)發(fā)了一種基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單傳感器一步實(shí)現(xiàn)Hg2+檢測(cè)。另外，Niu等[20]人采用兩種T-T堿基錯(cuò)配的DNA單鏈P1和P2：P1首先固定于電極表面，P2標(biāo)記有電活性物質(zhì)二茂鐵(Fc)。Hg2+誘導(dǎo)作用下，P1和P2之間憑借T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，成功在電極表面組裝形成穩(wěn)定DNA雙鏈，并產(chǎn)生與Hg2+濃度成正比例的Fc電化學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)在 1 nmoL/L～10 μmoL/L 濃度范圍內(nèi)對(duì)Hg2+線性響應(yīng)[20]。因此，可以說(shuō)，T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的應(yīng)用顯著促進(jìn)了Hg2+電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展[21-22]。

圖2 一步法檢測(cè)Hg2+的電化學(xué)生物傳感器示意圖

2 核酸信號(hào)放大策略對(duì)Hg2+檢測(cè)靈敏度的提升

基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)構(gòu)建的簡(jiǎn)單電化學(xué)生物傳感器中，多個(gè)Hg2+對(duì)應(yīng)一個(gè)DNA探針產(chǎn)生較弱的電信號(hào)響應(yīng)，因此靈敏度相對(duì)有限。隨著各種信號(hào)放大策略不斷被提出[23]，研究人員越來(lái)越關(guān)注核酸信號(hào)放大策略在Hg2+電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用，以追求更優(yōu)越的性能。

2.1 酶輔助的Hg2+循環(huán)放大策略

外切酶Ⅲ(Exo-Ⅲ)不依賴(lài)于特定核酸序列，不需要特定的識(shí)別位點(diǎn)，具有3’至5’端外切脫氧核糖核酸活性，可以催化具有3’平末端或凹陷末端的雙鏈DNA從3’端逐步降解。利用這一特性，ExoⅢ已被用于輔助Hg2+的循環(huán)利用，以放大信號(hào)，提高Hg2+檢測(cè)的靈敏度[24-27]。在Wu[28]構(gòu)建的傳感器中(如圖3)，一端標(biāo)記有電活性物質(zhì)Fc的DNA單鏈P1被固定在金電極表面，Hg2+存在時(shí)P1與DNA P2互補(bǔ)形成3’平末端雙鏈，觸發(fā)Exo-Ⅲ從3’端逐步降解該雙鏈DNA中的P1，導(dǎo)致電極表面Fc的數(shù)量減少，同時(shí)釋放出Hg2+。ExoⅢ輔助釋放出的Hg2+繼續(xù)參與以上這一過(guò)程，使得Hg2+被充分循環(huán)利用，實(shí)現(xiàn)少量的Hg2+即可減少大量的Fc，產(chǎn)生顯著的Fc信號(hào)降低，檢測(cè)限低至 6.2 pmoL/L。

圖3 基于Exo-Ⅲ輔助Hg2+循環(huán)放大策略的傳感器示意圖

2.2 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)[29-31]作為一種強(qiáng)有力的信號(hào)放大技術(shù)，由于非酶性和等溫性而顯示出一定的優(yōu)勢(shì)。HCR由Dirks和Piece率先報(bào)道[32]，一個(gè)典型的HCR(如圖4)包括一對(duì)末端有粘性的互補(bǔ)DNA發(fā)夾(H1、H2)和一個(gè)啟動(dòng)子(I鏈)。在沒(méi)有I鏈的情況下，H1和H2穩(wěn)定共存。一旦引入I鏈，由于I鏈與H1的粘性末端及莖部堿基互補(bǔ)，H1的發(fā)夾結(jié)構(gòu)就會(huì)被打開(kāi)。而打開(kāi)的H1與H2的粘性末端及莖部堿基也互補(bǔ)，使得H2的發(fā)夾結(jié)構(gòu)繼續(xù)被打開(kāi)，從而觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致H1、H2、H1、H2、H1......依次被循環(huán)打開(kāi)，形成具有H1-H2多重重復(fù)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)DNA雙鏈聚合物?；谶@樣的HCR放大原理，Yu等[33]人結(jié)合特異性T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，制備了一種新型的電化學(xué)生物傳感器。在目標(biāo)物Hg2+存在的情況下，T-Hg2+-T作用使得HCR的啟動(dòng)鏈成功被引入電極表面，觸發(fā)H1和H2級(jí)聯(lián)反應(yīng)自組裝成長(zhǎng)DNA雙鏈聚合物。此過(guò)程巧妙地將少量的Hg2+轉(zhuǎn)化成極長(zhǎng)的DNA雙鏈聚合物，DNA雙鏈聚合物中進(jìn)一步嵌入大量的電活性物質(zhì)甲苯胺藍(lán)TB以輸出放大的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)高效檢測(cè)Hg2+，檢測(cè)限低至 0.2 pmoL/L。

圖4 HCR的工作原理

2.3 DNAzyme輔助的信號(hào)放大策略

陽(yáng)離子特異性DNAzymes，一類(lèi)功能性核酸，因良好的穩(wěn)定性、易制備、設(shè)計(jì)靈活、可循環(huán)催化含有核糖核酸堿基rA的DNA底物在rA處裂解成兩段[34]，常被用作一種理想的生物催化劑來(lái)構(gòu)建靈敏的非酶分析方法[35-37]。Cai等[38]人通過(guò)結(jié)合Hg2+誘導(dǎo)激活的Mg2+特異性DNAzyme(Mg2+-DNAzyme)用于信號(hào)放大，提出了一種高靈敏度檢測(cè)Hg2+的電化學(xué)阻抗生物傳感器，并驗(yàn)證了其在實(shí)際樣品分析中具有應(yīng)用潛力。如圖5所示，圖中A部分首先合成了兩種分別修飾DNA發(fā)夾H3和H4的共聚物鏈P1和P2；圖中B部分將Hg2+作為觸發(fā)器，在T-Hg2+-T作用下使得D1與D2鏈互補(bǔ)結(jié)合形成特定序列的DNAzyme。Mg2+幫助下，DNAzyme選擇性地結(jié)合底物H2并在rA處發(fā)生裂解作用輸出sDNA片段。值得強(qiáng)調(diào)的是，少量的Hg2+輸入雖只能激活少量的DNAzyme，但DNAzyme對(duì)H2的裂解作用循環(huán)持續(xù)發(fā)生，可以輸出大量的sDNA，以進(jìn)一步與電極表面固載的H1雜交，從而觸發(fā)P1和P2中發(fā)夾DNA之間的HCR，在電極表面組裝形成一層DNA水凝膠。總的來(lái)說(shuō)，Hg2+的輸入經(jīng)DNAzyme作用產(chǎn)生大量的sDNA，sDNA觸發(fā)HCR得到非導(dǎo)電DNA水凝膠，非導(dǎo)電DNA水凝膠極大地阻礙了電子轉(zhuǎn)移，為構(gòu)建檢測(cè)Hg2+的高靈敏阻抗生物傳感器提供了可能。在最佳條件下，該阻抗型生物傳感器在 0.1 pmoL/L～10 nmoL/L 的濃度范圍內(nèi)對(duì)Hg2+具有良好的響應(yīng)，檢測(cè)限為 0.042 pmoL/L。

圖5 基于DNAzyme輔助放大信號(hào)的傳感器示意圖

2.4 催化發(fā)夾自組裝

催化發(fā)夾自組裝(CHA)是一種焓驅(qū)動(dòng)的無(wú)酶放大技術(shù)。與HCR類(lèi)似，典型的CHA[39]設(shè)計(jì)了一對(duì)互補(bǔ)的DNA發(fā)夾(H1和H2)，但互補(bǔ)的堿基部分被鎖定在各自的發(fā)夾結(jié)構(gòu)中。如圖6所示，當(dāng)沒(méi)有啟動(dòng)鏈存在時(shí)，H1和H2的反應(yīng)在動(dòng)力學(xué)上受限，以發(fā)夾的狀態(tài)穩(wěn)定存在。啟動(dòng)鏈存在時(shí)，啟動(dòng)鏈與H1的粘性末端和莖部堿基互補(bǔ)，觸發(fā)DNA鏈置換反應(yīng)打開(kāi)H1的莖部，H1新裸露的單鏈DNA區(qū)域繼續(xù)與H2的黏性末端和莖部堿基互補(bǔ)觸發(fā)第二次鏈置換反應(yīng)。在第二次鏈置換過(guò)程中，H1與H2從發(fā)夾結(jié)構(gòu)已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為H1/H2互補(bǔ)雙鏈，啟動(dòng)鏈同時(shí)也被置換下來(lái)繼續(xù)催化H1與H2的下一輪雜交。簡(jiǎn)而言之，啟動(dòng)鏈的輸入加速了兩個(gè)DNA發(fā)夾之間的雜交，轉(zhuǎn)化為大量H1/H2互補(bǔ)雙鏈輸出，該過(guò)程即為CHA。

圖6 CHA的工作原理

將目標(biāo)核酸作為啟動(dòng)鏈激活CHA已經(jīng)提出了許多靈敏的核酸檢測(cè)方法[40-42]。為了設(shè)計(jì)一個(gè)Hg2+響應(yīng)型CHA，Zhong等[43]人引入了Helper DNA和三個(gè)發(fā)夾探針，H1探針兩端用硫醇基修飾，H2和H3用Fc標(biāo)記。將Hg2+引入體系時(shí)，在T-Hg2+-T作用驅(qū)動(dòng)下，Helper DNA打開(kāi)H1，被打開(kāi)的H1裸露部分充當(dāng)啟動(dòng)鏈誘導(dǎo)發(fā)夾H2和H3的催化自組裝，形成剛性DNA三角結(jié)構(gòu)，同時(shí)釋放出Hg2+。釋放出的Hg2+繼續(xù)調(diào)控CHA循環(huán)發(fā)生，擴(kuò)增出大量DNA三角結(jié)構(gòu)。輸出的DNA三角結(jié)構(gòu)容易與電極接觸，將Fc引入電極表面產(chǎn)生放大的電化學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的靈敏檢測(cè)，檢測(cè)下限低至 0.12 pmoL/L。

3 納米機(jī)器在Hg2+電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用

3.1 納米開(kāi)關(guān)

DNA納米機(jī)器具有相對(duì)較高的穩(wěn)定性、靈活的可編程性和良好的生物相容性而被廣泛應(yīng)用?；诓煌墓押塑账峤Y(jié)構(gòu)已經(jīng)設(shè)計(jì)出了功能多樣的DNA納米器件，比如，依據(jù)T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)調(diào)控的DNA構(gòu)象轉(zhuǎn)換，研究人員將富T堿基的適體鏈作為分子開(kāi)關(guān)構(gòu)建了一個(gè)超靈敏控制釋放型適體傳感器[44]。適體鏈為單鏈時(shí)，是分子開(kāi)關(guān)的關(guān)閉狀態(tài)。隨著Hg2+的引入，T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的形成使得適配體彎曲成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，分子開(kāi)關(guān)被打開(kāi)，產(chǎn)生與Hg2+的濃度呈正相關(guān)電信號(hào)響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+的超靈敏定量檢測(cè)。

此外，Ma等[45]人利用DNA三向連接結(jié)構(gòu)提出了另一種DNA納米開(kāi)關(guān)。如圖7所示，DNA納米開(kāi)關(guān)由兩個(gè)相鄰但不連續(xù)的Watson-Crick堿基配對(duì)雙莖與一個(gè)序列特定的DNA配體識(shí)別域共同組成。DNA配體識(shí)別域位于雙莖中間，能夠捕獲分析物Hg2+。通過(guò)凝膠電泳分析，隨著識(shí)別域中T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)逐漸形成，雙莖與DNA配體識(shí)別域之間的三向連接處會(huì)

圖7 基于納米開(kāi)關(guān)的傳感器示意圖

發(fā)生細(xì)微的構(gòu)象變化使得DNA納米開(kāi)關(guān)被激活，實(shí)現(xiàn)開(kāi)(電導(dǎo)率增強(qiáng))與關(guān)(電導(dǎo)率抑制)。這種“開(kāi)”和“關(guān)”雙響應(yīng)的固定化DNA開(kāi)關(guān)能被nmoL/L水平的Hg2+激活，將其用于電化學(xué)傳感器中對(duì)Hg2+具有靈敏的定量分析能力。

3.2 “蟹爪”狀DNA納米機(jī)器

Chang等[46]人巧妙設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)潔高效的“蟹爪”狀DNA納米機(jī)器作為信號(hào)放大器，用于Hg2+超靈敏電化學(xué)分析。如圖8所示，在目標(biāo)Hg2+存在下，通過(guò)T-Hg2+-T作用調(diào)控四條DNA鏈(A、B、C和D)可快速簡(jiǎn)潔地自組裝成“蟹爪”狀DNA納米機(jī)器，一個(gè)“蟹爪”狀DNA納米機(jī)器具備四個(gè)DNAzyme。Mg2+輔助下，該DNA納米機(jī)器可以同時(shí)觸發(fā)四個(gè)相同的DNAzyme循環(huán)裂解底物反應(yīng)，將目標(biāo)Hg2+的輸入顯著轉(zhuǎn)化為大量標(biāo)記有Fc的DNA片段(H1’-Fc)，提高了檢測(cè)靈敏度。因此，該“蟹爪”狀DNA納米機(jī)器經(jīng)巧妙設(shè)計(jì)被賦予的強(qiáng)大DNAzyme循環(huán)裂解作用輔助電化學(xué)傳感平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了在 10 fmoL/L～100 nmoL/L 范圍內(nèi)對(duì)Hg2+簡(jiǎn)單而快速的定量檢測(cè)，為金屬污染物分析和環(huán)境監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中DNA納米機(jī)器的開(kāi)發(fā)利用提供了參考。

圖8 “蟹爪”狀DNA納米機(jī)器的工作原理

典型的Hg2+電化學(xué)生物傳感器的相關(guān)信息總結(jié)于表1中?？梢钥闯?，基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)構(gòu)建的簡(jiǎn)單電化學(xué)生物傳感器已經(jīng)呈現(xiàn)出對(duì)Hg2+的高選擇性響應(yīng)能力；而Exo-Ⅲ輔助Hg2+循環(huán)放大策略、HCR、DNAzyme輔助信號(hào)放大、CHA等核酸信號(hào)放大策略以及納米機(jī)器的采用則更是明顯拓寬了Hg2+電化學(xué)生物傳感器的線性響應(yīng)范圍，檢測(cè)下限低至pmoL/L級(jí)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+的靈敏檢測(cè)。

表1 不同汞離子電化學(xué)生物傳感器對(duì)比表

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，通過(guò)集成酶輔助Hg2+循環(huán)放大策略、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、DNAzyme輔助信號(hào)放大、催化發(fā)夾自組裝等核酸信號(hào)放大策略和新型DNA納米機(jī)器,電化學(xué)生物傳感平臺(tái)的檢測(cè)靈敏度已經(jīng)明顯提升，推動(dòng)Hg2+定量分析取得巨大進(jìn)展。但在實(shí)際應(yīng)用中，Hg2+電化學(xué)生物傳感器仍然存在部分問(wèn)題亟需解決：1)傳感器生物敏感元件的適用條件較窄，酸堿度及溫度偏離最優(yōu)條件都會(huì)產(chǎn)生影響；2)檢測(cè)功能單一，很少有傳感器在滿足Hg2+檢測(cè)需求的同時(shí)可以同步檢測(cè)其他種類(lèi)離子；3)實(shí)際樣品如肉類(lèi)、蔬菜、水果、谷物等的前處理流程還需要規(guī)范和簡(jiǎn)化。若處理不當(dāng)，殘留的樣品雜質(zhì)會(huì)直接干擾傳感器對(duì)Hg2+的信號(hào)響應(yīng)，造成傳感器檢測(cè)性能?chē)?yán)重下降。因此，我們?nèi)孕柙谔嵘蛢?yōu)化電化學(xué)生物傳感器的抗干擾能力方面進(jìn)行努力以增強(qiáng)其實(shí)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)分析能力。未來(lái)更加高效、功能多樣化的納米器件的設(shè)計(jì)與制備將是一個(gè)新的研究方向，有助于拓寬電化學(xué)生物傳感器的適用范圍，實(shí)現(xiàn)多種離子的同步檢測(cè)，應(yīng)對(duì)更加復(fù)雜的實(shí)際樣品。