陳 欣，慈文佳，李浙烽，蔡平梨，朱建津，*

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2.杭州康德權(quán)飼料有限公司，浙江 杭州 311107 ； 3.徐州市銅山區(qū)家禽技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 徐州 221100)

在經(jīng)歷高強(qiáng)度的產(chǎn)蛋期后，蛋雞腸道功能下降，各種代謝疾病的發(fā)生率升高，最終導(dǎo)致生產(chǎn)性能和產(chǎn)蛋率的降低[1]?？股卦粡V泛用于預(yù)防、控制蛋雞養(yǎng)殖過程中不斷發(fā)生的疾病。然而，近年來關(guān)于雞蛋中檢測出違禁抗生素的現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)，抗生素殘留、耐藥性等問題日益突出[2]。因此，高效、價格低廉、無毒副殘留的飼料添加劑成為研究關(guān)注的重點(diǎn)。益生菌在提高飼料轉(zhuǎn)化率，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，預(yù)防腹瀉等方面的優(yōu)勢使其有潛力作為高效、安全、無殘留的抗生素替代品[3]。Oh等[4]發(fā)現(xiàn)，日糧中添加枯草芽孢桿菌CLS2 (107CFU·kg-1)改變了被沙門氏菌感染的肉雞糞便中微生物多樣性，增加了糞便中有益菌相對豐度，減少了致病菌相對豐度。有研究發(fā)現(xiàn)，肉雞攝入羅伊氏乳桿菌(108CFU·d-1)可以激活Wnt/β-catenin和抑制Notch信號通路[5]，促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)腸道干細(xì)胞分化為杯狀細(xì)胞，增加黏蛋白2 (MUC2)分泌，改善腸道屏障功能。此外，日糧中添加嗜酸乳桿菌(2.0×107CFU·kg-1)可以提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化率[6]。在產(chǎn)蛋后期蛋雞的日糧中添加丁酸梭菌(8.0×108CFU·kg-1)，可以顯著提高腸道內(nèi)容物中脂肪酶活性[7]。

氨是機(jī)體的代謝廢物，主要產(chǎn)自腸道。氨可以通過微生物產(chǎn)生的脲酶分解尿素或者尿酸生成，也可以通過微生物脫氨酶對蛋白質(zhì)的消化及脫氨作用產(chǎn)生[8-9]。氨的產(chǎn)生會誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞受損，同時具有潛在的致癌性[10]。雞舍中氨濃度過高會導(dǎo)致雞食欲減退，生產(chǎn)性能降低，被疾病感染風(fēng)險升高等各種不良影響[11]。此外，氨氣是蛋雞養(yǎng)殖過程中主要的致臭氣體，對生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的影響。通過補(bǔ)充益生菌減少氨的生成具有良好的發(fā)展?jié)摿?。有研究表明，攝入植物乳桿菌可以有效提高硫代乙酰胺誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠的存活率，顯著降低血氨和糞氨水平[12]。日糧補(bǔ)充干酪乳桿菌可以顯著降低肉雞小腸內(nèi)容物中脲酶的活性，減少氨的生成[13]。補(bǔ)充乳酸桿菌可以提高腸道短鏈脂肪酸含量，降低腸道pH，減少腸道對氨的吸收[14]。

雖然益生菌在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的有益作用已得到大量研究證實(shí)，但是，單一菌株的作用有限，在實(shí)際應(yīng)用中效果也不穩(wěn)定。一些研究表明，益生菌混合制劑可能整合了不同菌株的特性，結(jié)合不同的益生菌菌株比使用單一菌株更有效[15-16]。芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，可以產(chǎn)生抗逆性的芽孢，抵抗消化道中酸性環(huán)境，保持良好的生物活性[17]。乳酸菌是一種可以在肉雞腸道中定植，通過產(chǎn)生有機(jī)酸、多糖等活性成分調(diào)控機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)，緩解腸道炎癥[18]。結(jié)合使用嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌可能兼顧二者的特性達(dá)到更好的應(yīng)用效果。因此，本試驗(yàn)以50周齡海蘭褐蛋雞為研究對象，在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取兩種不同益生菌添加水平，研究其對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、腸道抗氧化能力的影響，并對氨氮含量與盲腸微生物豐度進(jìn)行了相關(guān)性分析，為其充分開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用到的復(fù)合益生菌由康丸德川科技有限公司提供，成分包括：嗜酸乳桿菌CGMCC1.1878(活菌數(shù)>1×106CFU·g-1)和枯草芽孢桿菌ACCC11088(活菌數(shù)>1×106CFU·g-1)。所用到的海蘭褐蛋雞由南京康德權(quán)蛋雞養(yǎng)殖基地提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

2 160只50周齡的海蘭褐蛋，體重(2.0±0.1)kg，產(chǎn)蛋率(86.7±0.3)%，雞隨機(jī)分為3組，每組10個重復(fù)，每個重復(fù)72只。對照組(NC組)飼喂基礎(chǔ)日糧，基礎(chǔ)日糧配制參考NRC(1994)，配方及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中分別添加益生菌復(fù)合制劑250 mg·kg-1(LD組)、500 mg·kg-1(HD組)。試驗(yàn)期49 d。雞舍環(huán)境溫度23 ℃，每天光照時長16 h。所有試驗(yàn)動物均可自由采食和飲水。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 生產(chǎn)性能及蛋品質(zhì)

每天記錄各組蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)，總蛋質(zhì)量，每周統(tǒng)計飼料消耗量。49 d時，每個重復(fù)隨機(jī)挑選1枚雞蛋，用于檢測雞蛋的品質(zhì)，蛋品質(zhì)檢測方法參考Feng等[19]的研究。

1.3.2 樣品收集

每個重復(fù)隨機(jī)挑選1只蛋雞，進(jìn)行屠宰。翼靜脈取血并收集于含有肝素鈉的抗凝管中，4 000 r·min-1離心15 min，吸取上清液血漿-80 ℃保存。解剖腸道后收集盲腸內(nèi)容物，液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存。收集回腸和盲腸組織用于檢測腸道抗氧化指標(biāo)。取1 cm盲腸組織，PBS洗去內(nèi)容物，0.4%多聚甲醛固定24 h用于組織切片觀察。

1.3.3 腸道抗氧化指標(biāo)測定和組織形態(tài)學(xué)觀察

總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測試劑盒，購于南京建成生物工程研究所，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。盲腸組織H&E切片制作和染色方法參考劉江英等[20]的方法。

1.3.4 血漿和盲腸內(nèi)容物生化指標(biāo)

血漿和盲腸內(nèi)容物中氨氮，尿素氮，尿酸含量用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。盲腸內(nèi)容物中，谷氨酸脫氫酶(GDH)，谷氨酰胺合成酶(GS)活性用南京建成試劑盒測定，脲酶和尿酸酶活性檢測方法參考之前報道的方法[21]。

1.3.5 氣相色譜測定盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸

短鏈脂肪酸的測定方法參考之前的研究[22]。

1.3.6 盲腸內(nèi)容物中微生物檢測

盲腸內(nèi)容物中DNA提取，PCR擴(kuò)增，Illumina MiSeq測序以及數(shù)據(jù)的處理參考Liu等[23]的報道。

表1 基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)組成與含量

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

使用IBM SPSS Statistics 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布則使用單因素方差分析(ANOVA)以及Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則使用Kruskal-Wallis分析，微生物豐度與氨氮相關(guān)性使用皮爾遜相關(guān)性分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的影響

由圖1可知，在第4～7周HD組產(chǎn)蛋率顯著高于NC組(P<0.05)，在第3、4、6、7周LD組產(chǎn)蛋率顯著高于NC組(P<0.05)。整個試驗(yàn)周期中，與NC組相比，HD組蛋雞每日飼料攝入量顯著降低(P<0.05)，LD組每日飼料攝入量有所下降但差異不顯著(P>0.05)。料蛋比隨著嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合制劑含量升高有下降趨勢，但組間差異不顯著(P>0.05)。由表2 可知，與NC組相比，HD組蛋白高度和哈夫單位有上升的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。這表明，飼糧添加嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合制劑可以提高產(chǎn)蛋后期蛋雞的產(chǎn)蛋率，但是對雞蛋品質(zhì)無顯著影響(P>0.05)。

*代表NC組與LD組間有顯著差異(P<0.05)，#代表HD組與NC組間有顯著差異(P<0.05)；柱上無相同字母的表示組間差異顯著(P<0.05)。下同。* represented a significant difference between NC group and LD group (P<0.05)， and # represented a significant difference between HD group and NC group (P<0.05)； No same letters on the bars indicated significant difference among groups (P<0.05). The same as below.圖1 飼糧添加復(fù)合益生菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響Fig.1 Effects of dietary supplementation with compound probiotics on laying performance of late-phase laying hens

2.2 復(fù)合益生菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞腸道抗氧化能力和盲腸組織形態(tài)的影響

如圖2所示，與NC組相比，LD組回腸組織CAT、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，HD組回腸組織T-AOC，CAT、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。在盲腸中，與NC組相比，LD組中T-AOC活性顯著升高(P<0.05)，同時，HD組中T-AOC，CAT、SOD、GSH-Px活性均顯著上升(P<0.05)。HD組回腸T-AOC，GSH-Px活性顯著高于LD組。如圖3所示，NC組蛋雞盲腸刷狀緣出現(xiàn)畸形，同時發(fā)現(xiàn)隱窩消失的現(xiàn)象，LD和HD組蛋雞盲腸結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)現(xiàn)明顯的異常變化。這說明日糧補(bǔ)充嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合制劑可以提高蛋雞盲腸和回腸抗氧化能力，增加盲腸的完整性。

表2 飼糧添加復(fù)合益生菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

圖2 飼糧添加復(fù)合益生菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞盲腸和回腸組織抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of dietary supplementation with compound probiotics on the antioxidant capacity of cecum and ileum tissues in late-phase laying hens

圖3 飼糧添加復(fù)合益生菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞盲腸組織形態(tài)結(jié)果的影響(H&E染色，×200)Fig.3 Effects of dietary supplementation with compound probiotics on the histopathology of cecum in late-phase laying hens (H&E staining， ×200)

2.3 復(fù)合益生菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞氨代謝和相關(guān)酶活性的影響

如圖4所示，HD組蛋雞盲腸內(nèi)容物中的氨氮，尿素氮含量顯著(P<0.05)低于NC組和LD組，尿酸含量顯著(P<0.05)高于NC組，LD組蛋雞盲腸內(nèi)容物中氨氮、尿素氮、尿酸水平與NC組相比無顯著差異(P>0.05)。血漿血氨、尿素、尿酸含量在3個組間沒有顯著的差異(P>0.05)。

圖4 飼糧添加復(fù)合益生菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞盲腸內(nèi)容物和血漿中氨代謝物含量的影響Fig.4 Effects of dietary supplementation with compound probiotics on the ammonia-related metabolites in the contents of the cecum and plasma in late-phase laying hens

如表3所示，與NC組相比，HD組中盲腸內(nèi)容物中尿酸酶相對活性顯著下降(P<0.05)，LD組尿酸酶活性有下降的趨勢，但與NC組的差異不顯著(P>0.05)。盲腸內(nèi)容物中脲酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶在3個組間無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼糧補(bǔ)充復(fù)合益生菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞盲腸內(nèi)容物中氨代謝相關(guān)酶活性的影響

2.4 復(fù)合益生菌對盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的影響

如圖5所示，飼糧添加嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合制劑可以顯著增加盲腸內(nèi)容物中總短鏈脂肪酸的含量。其中，LD組蛋雞盲腸內(nèi)容物中乙酸、正戊酸、異戊酸顯著高于NC組(P<0.05)，在HD組中，乙酸、丙酸、正丁酸含量顯著高于NC組(P<0.05)。LD組和HD組相比，幾種短鏈脂肪酸含量之間沒有顯著差異(P>0.05)。

圖5 飼糧補(bǔ)充嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合制劑對產(chǎn)蛋后期蛋雞盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量的影響Fig.5 Effects of dietary supplementation with compound probiotics on the short-chain fatty acids in contents of cecum in late-phase laying hens

2.5 盲腸內(nèi)容物中微生物相對豐度與氨水平間的相關(guān)性分析

如圖6所示，盲腸內(nèi)容物中的擬桿菌相對豐度與氨氮、尿素含量顯著正相關(guān)，梭狀芽孢桿菌屬相對豐度與尿酸水平顯著正相關(guān)。別樣桿菌和考拉桿菌屬相對豐度與尿酸顯著負(fù)相關(guān)；瘤胃球菌、別樣桿菌與氨氮含量顯著負(fù)相關(guān)；梭狀芽孢桿菌屬與尿素含量顯著負(fù)相關(guān)。

圖6 產(chǎn)蛋后期蛋雞盲腸內(nèi)容物中氨氮、尿素、尿酸與盲腸微生物相對豐度相關(guān)性分析Fig.6 Correlation between ammonia nitrogen， urea and uric acid in cecum contents and relative abundance of cecum microbial in late-phase laying hens

3 討論

腸道是雞體內(nèi)重要的消化器官，99%的營養(yǎng)物質(zhì)要靠腸道吸收，同時也是重要的免疫器官，70%以上的免疫細(xì)胞位于腸道黏膜中[24]。然而，集約化養(yǎng)殖的背景下，處在產(chǎn)蛋后期的蛋雞腸道屏障功能受損，消化吸收能力下降，并伴隨著腸道炎癥的發(fā)生，最終導(dǎo)致生產(chǎn)性能急劇下降[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合制劑可以提高腸道抗氧化能力和抗氧化酶水平，增加盲腸完整性，從而提高產(chǎn)蛋后期蛋雞的生產(chǎn)性能。然而，在本試驗(yàn)中，益生菌補(bǔ)充對雞蛋品質(zhì)的影響較小。Guo等[25]發(fā)現(xiàn)，飼糧補(bǔ)充枯草芽孢桿菌前4周對蛋品質(zhì)無顯著影響，第8周時，蛋殼強(qiáng)度顯著高于對照組，第20周試驗(yàn)組與對照組蛋白高度出現(xiàn)顯著差異，這說明益生菌對雞蛋品質(zhì)的影響可能與益生菌干預(yù)時間有關(guān)。

腸道中的細(xì)菌30%為脲酶陽性菌，能夠通過產(chǎn)生脲酶，分解尿素產(chǎn)氨，為自身提供氮源[37]。為了探究日糧補(bǔ)充復(fù)合益生菌是否可以通過改變腸道菌群從而影響氨氮代謝。我們基于16S rRNA測序結(jié)果，將腸道中尿素、尿酸以及氨含量與腸道微生物相對豐度進(jìn)行斯皮爾曼相關(guān)性分析。結(jié)果表明，擬桿菌、梭狀桿菌、瘤胃球菌、別樣桿菌、考拉桿菌與氨氮代謝顯著相關(guān)，說明這幾種菌可能在調(diào)控腸道內(nèi)容物氨氮含量的過程中發(fā)揮了作用。擬桿菌屬和瘤胃球菌屬主要通過發(fā)酵碳水化合物為自身提供能量，產(chǎn)生的氨氣較少，梭菌屬的微生物具有較強(qiáng)的產(chǎn)氨能力[21]。然而，腸道菌群影響腸道氨氮代謝的報道相對較少，具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

飼糧添加嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合制劑可以改善產(chǎn)蛋后期蛋雞的生產(chǎn)性能，增加腸道組織抗氧化能力，提高盲腸內(nèi)容物中的短鏈脂肪酸含量和抑制腸道中氨氮的生成，并且添加量為500 mg·kg-1時的效果比250 mg·kg-1時效果更好。