奚 丹，蘇 卿

（1.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130000； 2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧 大連 116000）

國(guó)際糖尿病聯(lián)盟2020 年的數(shù)據(jù)表明，全球共有4.63億糖尿病患者，在成年人群中的發(fā)病率為9.3%，預(yù)計(jì)到2040 年發(fā)病人數(shù)將會(huì)突破6.42 億［1］。糖尿病腎病為糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病患者殘疾及死亡的首要原因，因而進(jìn)行早期預(yù)防極為重要［2］。目前，臨床上控制高血壓和降低血糖是預(yù)防及治療糖尿病腎病的主要手段，但存在用藥局限及諸多不良反應(yīng)，效果難以令人滿意［3］。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激是延緩該病進(jìn)展的有效方法［4］。中藥應(yīng)用歷史悠久，具有多靶點(diǎn)、多途徑的優(yōu)勢(shì)，在降低肌酐值、尿蛋白量及改善腎功能等方面均具有較大的優(yōu)勢(shì)，日益受到研究者的關(guān)注［5］。

芹菜素為黃酮類化合物，主要以植物黃色素的形式廣泛存在于多種蔬菜、中藥材及水果中［6］，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤等多種藥理作用［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可顯著降低高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的2 型糖尿病大鼠及四氧嘧啶聯(lián)合STZ 誘導(dǎo)的1 型糖尿病大鼠的血糖水平［8-10］。然而，關(guān)于芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎功能的保護(hù)作用及其分子機(jī)制并未闡明。本研究通過高脂飼料聯(lián)合STZ 法建立糖尿病大鼠模型，給予芹菜素干預(yù)，探討其對(duì)腎功能的保護(hù)作用，并從炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的角度闡述分子機(jī)制，為芹菜素應(yīng)用于糖尿病早期腎損傷的防治提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2018-0004。

1.2 試劑與藥物 芹菜素（湖南賽禾生物科技有限公司，純度＞90%，批號(hào)180419），用0.5% 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成混懸液。厄貝沙坦片（美國(guó)威斯敏斯特公司，規(guī)格75 mg／片，批號(hào)69367-119-01）；STZ（美國(guó)Sigma 公 司，批號(hào)046K1206）；血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）檢測(cè)試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號(hào)20190320、20190325）；白細(xì)胞介素2（IL-2）、IL-6、C 反應(yīng)蛋白（CRP）檢測(cè)試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司，批號(hào)18070601、18091101、18112501）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（上海酶研生物科技有限公司，批號(hào)20190118、20190328、20181225）；核因子κB p65（NF-κB p65）、NFκB 抑制蛋白α（IκBα）、核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素氧合酶1（HO-1）、甘油醛3 磷酸脫氫酶（GAPDH）抗 體（英 國(guó) Abcam 公 司，批號(hào) ab207297、ab109300、ab137550、ab189491、ab8245）。

1.3 儀器 BSA2235 型分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；KDC-160R 型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；卓越型血糖儀（瑞士羅氏公司）；Chemray 240型全自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；LKB-1 型超薄切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；YKT-2800 型顯微鏡（上海永科光學(xué)儀器公司）；Epoch 型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；X6 型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；MiniTrans-blot 型電轉(zhuǎn)印槽及165-8001 型垂直電泳槽（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射STZ 方法建立糖尿病大鼠模型［11］。大鼠經(jīng)高糖高脂飼料喂養(yǎng)4 周后劑量腹腔注射30 mg／kg STZ 溶液，3 d 后測(cè)定空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG≥11.1 mmol／L 者視為造模成功，F(xiàn)BG＜11.1 mmol／L 者排除。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦組（15 mg／kg）及芹菜素低、高劑量組（50、100 mg／kg），每組10 只，另取10 只健康大鼠（標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)）作為正常組，灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1 次，給藥4 周，其中模型組和正常組大鼠灌胃等體積0.5%CMC-Na 溶液。末次給藥結(jié)束，稱定各組大鼠體質(zhì)量，并用代謝籠收集24 h 尿液；隨后腹腔注射20%烏拉坦進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃、3 000 r／min 離心15 min，分離得血清，分裝后備用；頸椎脫位法處死大鼠，分離腎臟組織，稱定質(zhì)量后備用。

2.2 FBG、24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數(shù)檢測(cè)采用血糖儀測(cè)各組大鼠FBG 水平；通過雙縮脲法采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)24 h 尿蛋白量；通過酶法采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)Scr、BUN 水平；腎肥大指數(shù)＝雙腎質(zhì)量／體質(zhì)量。

2.3 HE 染色觀察腎組織病理改變 使用4% 多聚甲醛固定腎臟組織，梯度乙醇脫水，石蠟包埋后切片，經(jīng)脫蠟、水洗及蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織病理改變情況。

2.4 腎組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取各組大鼠部分腎臟組織，用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液進(jìn)行充分裂解，4 ℃、12 000 r／min 離心10 min，分離得上清液，分裝后凍存?zhèn)溆?。參照說明書中操作步驟，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法分別檢測(cè)腎組織炎癥反應(yīng)指標(biāo)IL-2、IL-6、CRP 水平，氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、CAT 活性及MDA 水平。

2.5 Western blot 法檢測(cè)腎組織NF-κB p65、IκBα、Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá) 取“2.4” 項(xiàng)下腎組織勻漿上清液，二喹啉甲酸法檢測(cè)蛋白濃度，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及一抗、二抗孵育后，采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色、曝光及顯影。圖片掃描后，用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 18.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠體質(zhì)量及FBG 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量降低（P＜0.01），F(xiàn)BG 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素各劑量組大鼠體質(zhì)量增加（P＜0.01），F(xiàn)BG 水平降低（P＜0.01），而陽(yáng)性藥厄貝沙坦組大鼠體質(zhì)量、FBG 水平均無明顯變化（P＞0.05），見表1。

表1 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠體質(zhì)量及FBG 水平的影響（±s， n＝10）

表1 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠體質(zhì)量及FBG 水平的影響（±s， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.2 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數(shù)均升高（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素各劑量組和厄貝沙坦組大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數(shù)均降低（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數(shù)的影響（±s， n＝10）

表2 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數(shù)的影響（±s， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎組織病理改變的影響 正常組大鼠腎組織未見系膜細(xì)胞增生，細(xì)胞排列緊密、胞漿豐富，腎小管間質(zhì)區(qū)域結(jié)構(gòu)清晰，腎小球體積正常；模型組大鼠腎組織系膜基質(zhì)增多，腎小管可見炎性浸潤(rùn)、空泡及腫脹，腎小球體積增大；芹菜素各劑量組和厄貝沙坦組大鼠腎組織系膜基質(zhì)稍有增多，腎小管炎性浸潤(rùn)、空泡及腫脹等病理改變程度均有不同程度的緩解，腎小球體積增大趨勢(shì)也低于模型組，見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理改變情況（HE 染色，×200）

3.4 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎組織炎癥反應(yīng)的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織IL-2、IL-6 及CRP 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素各劑量組和厄貝沙坦組大鼠腎組織IL-2、IL-6 及CRP 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），提示芹菜素具有抑制糖尿病大鼠腎組織炎癥反應(yīng)的作用，見表3。

表3 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎組織炎癥反應(yīng)的影響（±s， n＝10）

表3 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎組織炎癥反應(yīng)的影響（±s， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎組織NF-κB p65、IκBα 蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織NF-κB p65蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），而IκBα 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素各劑量組和厄貝沙坦組大鼠腎組織NF-κB p65 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），而IκBα 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），提示芹菜素抑制腎組織炎癥反應(yīng)與調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)，見圖2、表4。

圖2 各組大鼠腎組織NF-κB p65、IκBα 蛋白條帶圖

表4 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎組織NF-κB p65、IκBα 蛋白表達(dá)的影響（±s， n＝10）

表4 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎組織NF-κB p65、IκBα 蛋白表達(dá)的影響（±s， n＝10）

注：與正常組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎組織氧化應(yīng)激的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織SOD、CAT 活性降低（P＜0.01），而MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素各劑量組和厄貝沙坦組大鼠腎組織SOD、CAT 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），而MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），提示芹菜素具有減輕糖尿病大鼠腎組織氧化應(yīng)激的作用，見表5。

表5 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎組織SOD、CAT 活性及MDA 水平的影響（±s， n＝10）

表5 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎組織SOD、CAT 活性及MDA 水平的影響（±s， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.7 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素各劑量組和厄貝沙坦組大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.01），提示芹菜素減輕腎組織氧化應(yīng)激的作用與調(diào)控Nrf2／HO-1 信號(hào)通路有關(guān)，見圖3、表6。

表6 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)的影響（±s， n＝10）

表6 芹菜素對(duì)糖尿病大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)的影響（±s， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

圖3 各組大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白電泳圖

4 討論

糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，長(zhǎng)期的高糖環(huán)境可以激活腎臟組織中的炎癥反應(yīng)，一方面能刺激細(xì)胞外基質(zhì)聚集，增厚基底膜并逐步出現(xiàn)腎小球硬化；另一方面也能對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞造成直接損害［12］。IL-2、IL-6 及CRP 均為常見的炎性細(xì)胞因子，參與了糖尿病腎病的病情進(jìn)展并直接與蛋白尿水平呈正相關(guān)［13］。研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可以有效降低游離脂肪酸誘導(dǎo)的L02 細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-8 等炎性因子的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)［14］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，芹菜素能夠降低糖尿病大鼠腎組織IL-2、IL-6、CRP 水平，具有抑制糖尿病大鼠腎組織炎癥反應(yīng)的作用。NF-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，可以介導(dǎo)IL-2、IL-6、CRP 等多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［15］。研究發(fā)現(xiàn)，給予動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠芹菜素治療后，NF-κB p65 蛋白表達(dá)降低，表明芹菜素改善大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的作用與調(diào)控NFκB 信號(hào)通路有關(guān)［16］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芹菜素治療后，糖尿病大鼠腎組織NF-κB p65 蛋白表達(dá)降低，而IκBα 蛋白表達(dá)增加，表明調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)是芹菜素保護(hù)糖尿病大鼠腎功能作用的潛在機(jī)制。

腎臟是氧化應(yīng)激最敏感的器官之一，氧化應(yīng)激是糖尿病腎損傷發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，也是糖尿病腎病的誘發(fā)因素［17］。長(zhǎng)期的高血糖環(huán)境可導(dǎo)致抗氧化酶的糖基化，使SOD、CAT 等抗氧化酶活性降低，減弱抗氧化系統(tǒng)清除能力；同時(shí)，持續(xù)的高血糖也能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生MDA 等過氧化物產(chǎn)物，損傷腎臟，并逐漸發(fā)展為糖尿病腎?。?8］。本研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素能夠增加糖尿病大鼠腎組織SOD、CAT 活性，降低MDA 水平，具有減輕糖尿病大鼠腎組織氧化應(yīng)激的作用。Nrf2 是具有調(diào)控抗氧化應(yīng)激活性的轉(zhuǎn)錄因子，在正常生理狀態(tài)下，胞質(zhì)內(nèi)的胞質(zhì)接頭蛋白Keap1 與Nrf2 形成復(fù)合物，使Nrf2 的活性被抑制；在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Keap1與Nrf2 復(fù)合物解離，Nrf2 游離后進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，激活抗氧化酶基因HO-1 的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力［19］。楊麗等［20］研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可以升高妊娠期糖尿病大鼠肝組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果同樣證實(shí)，經(jīng)芹菜素治療后，糖尿病大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)升高，表明調(diào)控Nrf2／HO-1 信號(hào)通路進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激水平是芹菜素保護(hù)糖尿病大鼠腎功能作用的又一個(gè)潛在機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)芹菜素能夠降低糖尿病大鼠FBG 水平、24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數(shù)，且能有效緩解腎組織病理性改變，證實(shí)其具有保護(hù)糖尿病大鼠腎功能的作用；進(jìn)一步機(jī)制研究表明，該作用與抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激有關(guān)，但深入機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。