劉漢福胡 晶謝琴琴姜 北肖朝江王金達沈 磊*

［1.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室（培育）， 云南 大理 671000； 2.大理大學藥學院，云南 大理 671000］

近年來，黃芪已被證明具有一定治療糖尿病的作用，如黃芪降糖顆粒能降低2 型糖尿病小鼠的空腹血糖［1］；黃芪消渴方聯(lián)合胰島素治療氣陰兩虛型2 型糖尿病時，療效和安全性均優(yōu)于單用胰島素［2］；黃芪桂枝五物湯能改善氣虛血瘀型糖尿病患者的周圍神經(jīng)病變［3］；黃芪烏梅配方可降低自發(fā)性糖尿病大鼠的血糖和游離脂肪酸［4］。除此之外，黃芪多糖、黃芪甲苷和黃芪黃酮也有控制血糖和治療糖尿病并發(fā)癥的療效［5-7］。

藥用正品黃芪為蒙古黃芪Astragalus membranaceusvar.mongholicus或膜莢黃芪Astragalus membranaceus的根，生長于高緯度地區(qū)。云南沒有正品黃芪分布，卻是黃芪屬植物在我國的分布中心之一，且絕大部分生長于滇西北的高海拔地區(qū)，其獨特的藥用價值亟待開發(fā)。本課題組前期對不同種黃芪屬植物的化學成分進行了研究［8-10］，發(fā)現(xiàn)同為黃芪亞屬，梭果黃芪Astragalus ernestiiComber 主要成分與正品黃芪類似，多為環(huán)阿屯烷型三萜皂苷類和黃酮苷類化合物，而云南黃芪Astragalus yunnanensisFranch 中大多數(shù)為甾體類成分。因此，本研究聚焦胰島素抵抗這一2 型糖尿病的關鍵特征來探討梭果黃芪和云南黃芪是否具有與正品黃芪類似的治療糖尿病的潛力，為了解滇西北黃芪屬植物的藥用價值提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞 人肝癌HepG2 細胞來源于ATCC 細胞庫，購自武漢普諾賽生命科技有限公司，于常規(guī)高糖DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代，取第3～10 代細胞用于實驗。

1.2 試劑與藥物 正品黃芪的原產(chǎn)地為甘肅，購自云南省大理市下關萬花路健之佳藥店，批號20 180102；梭果黃芪和云南黃芪全株采于云南省香格里拉，經(jīng)大理大學張德全教授鑒定為梭果黃芪Astragalus ernestiiComber 和云南黃芪Astragalus yunnanensisFranch。乙腈（批號211921）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；純凈水（批號20211103）購自杭州娃哈哈集團有限公司；鹽酸吡格列酮（批號P7701）、牛血清白蛋白（BSA，批號1016J051）、牛胰島素（批號121R021）、胰蛋白酶（批號20190819）、己糖激酶測定試劑盒（批號20201211）、蛋白濃度測定試劑盒（BCA 法，批號20210513），CCK-8 試劑盒（批號508E013）均購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號2072064）、胎牛血清（批號2168090RP）均購自美國Gibco 公司；DMEM 無糖無酚紅培養(yǎng)基（批號PM150278）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；葡萄糖（批號SLBZ6903）購自美國Sigma 公司；葡萄糖檢測試劑盒（GOD-POD 法，批號0713A19）購自北京雷根生物技術有限公司；RNA 提取試劑盒（批號7E413L0）、反轉錄試劑盒（批號7E591D1）、Real-time PCR 試劑盒（批號7E561F1）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）、葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）、β-肌動蛋白（β-actin）引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成。

1.3 儀器 生物安全柜（BSC-1000ⅡA2 型），蘇州安泰空氣技術有限公司；CO2培養(yǎng)箱（NU-5510／E 型），美國Nuaire 公司；高速冷凍離心機（HC-3018R 型），安徽中科中佳科學儀器有限公司；相差顯微鏡（CKX41 型），日本Olympus 公司；多功能酶標儀（Varisoskan LUX 型），美國Thermo 公司；PCR 儀（785BR15145 型），美國Bio-Rad 公司；核酸蛋白測定儀（N60 型），德國Implen 公司；高效液相色譜儀（1260 型），美國安捷倫公司；電子天平（EL204 型），賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

2 方法

2.1 黃芪提取物制備 將3 種黃芪的干燥根（正品黃芩37.7 g、梭果黃芩16.2 g、云南黃芩16.6 g）分別粉碎成粗粉，經(jīng)乙醇熱回流提取3 次（75%乙醇1 h、95%乙醇2 h、95%乙醇2 h），減壓濃縮后得浸膏，再經(jīng)冷凍干燥后制成凍干粉，得率分別為正品黃芪41.5%、梭果黃芪13.2%、云南黃芪13.9%。細胞實驗時，用DMSO 將提取物配制成生藥量200 mg／mL 的母液，渦旋混勻，超聲溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾后備用，再用培養(yǎng)基稀釋母液至相應質(zhì)量濃度用于實驗。

2.2 黃芪提取物對HepG2 細胞相對活力和葡萄糖消耗量的影響 取對數(shù)生長期的HepG2 細胞，以1×105／mL 的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，待細胞貼壁長至融合度80%后，棄培養(yǎng)基，PBS 洗1 次，加入含生藥10、1、0.1、0.01、0.001 g／L 的3 種黃芪的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基（含10%FBS，25 mmol／L 葡萄糖）處理細胞24 h，另設不加藥物的正常組（高糖DMEM 孵育細胞）和空白組（僅有培養(yǎng)基，無細胞）。取3 μL 上清液用葡萄糖氧化酶法（GOD-POD 法）檢測葡萄糖含量，再將培養(yǎng)基換為含CCK-8 試劑的培養(yǎng)基于37 ℃孵育1 h 后測定450 nm 波長處的吸光度（A）值。細胞相對活力＝A給藥孔／A正常對照孔×100%；葡萄糖消耗量＝空白對照孔葡萄糖含量－測試孔葡萄糖含量；標準化葡萄糖消耗量＝葡萄糖消耗量／細胞相對活力。

2.3 HepG2 細胞胰島素抵抗模型的建立 按“2.2” 項下方法將細胞接種于96 孔板，貼壁培養(yǎng)至融合度80%后，吸棄培養(yǎng)基，PBS 洗1 次，加入含1×10－5～1×10-8mol／L 胰島素的無酚紅高糖DMEM，另設正常組（加入不含胰島素的無酚紅高糖DMEM）和空白組（僅有培養(yǎng)基，無細胞），培養(yǎng)24、36、48 h 后，按“2.2” 項下方法檢測細胞相對活力和標準化葡萄糖消耗量。

2.4 黃芪提取物對HepG2 細胞胰島素抵抗的影響

2.4.1 細胞相對活力和標準化葡萄糖含量測定 經(jīng)胰島素抵抗模型條件的摸索，確定采用含1×10-6mol／L 胰島素的高糖DMEM 孵育細胞36 h 建立胰島素抵抗細胞模型。細胞接種于96 孔板并生長至對數(shù)生長期后，分成12 組，分別為正常組、模型組、陽性藥吡格列酮組及正品黃芪、梭果黃芪、云南黃芪各3 個劑量組（1、0.1、0.01 g／L），除正常組（加入不含胰島素的高糖DMEM）外，各組均加入含1×10-6mol／L 胰島素的無酚紅高糖DMEM 孵育36 h，棄培養(yǎng)基后PBS 洗1 次，加入含不同劑量黃芪的無血清無酚紅高糖DMEM（含0.2% BSA），正常組和模型組加入不含藥的培養(yǎng)基，吡格列酮組加入含0.003 92 g／L（1×10-6mol／L）吡格列酮的培養(yǎng)基，作用24 h 后測定細胞相對活力和標準化葡萄糖消耗量。

2.4.2 己糖激酶活性檢測 將細胞以5×105／mL 的密度接種于12 孔板中，每孔2 mL，按“2.4.1” 項下方法分組（其中3 種黃芪僅設1、0.1 g／L 2 個劑量）、造模和藥物處理，24 h 后每孔收集5×105個細胞，加入提取液裂解細胞，4 ℃、8 000×g離心10 min，取30 μL 上清液與己糖激酶試劑盒中的反應試劑進行反應，于20、320 s 時檢測340 nm波長處的A值，計算己糖激酶活性，同時采用BCA 法測定蛋白濃度。

2.4.3GLUT1、GLUT4 mRNA 表達檢測 按“2.4.2” 項下方法接種細胞、分組、造模和藥物處理，提取各孔細胞的總RNA，并測定RNA 濃度，按照試劑盒說明書方法將RNA 逆轉錄為cDNA。加入特異性引物后用實時熒光定量PCR 法擴增目的片段并檢測基因表達，每孔重復3 次，計算平均值作為每個樣品的CT值，每組設3 個復孔。以βactin為內(nèi)參，用2－ΔΔCT法分析GLUT1、GLUT4 mRNA 相對表達。GLUT1 正向序列CTGTCGTGTCGCTGTTTGTG，反向序列GGCCACAAAGCCAAAGATGG；GLUT4 正向序列CTT CTTTGAGATTGGCCCTGG，反向序列AGGTGAAGATGAAG AAGCCAAGC；β-actin正向序列GAGACCTTCAACACCCC AGCC，反向序列AATGTCACGCACGATTTCCC。

2.5 HPLC 分析 取3 種黃芪的凍干粉，加色譜純甲醇溶解至13.3 mg／mL，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后備用。色譜條件為Agilent SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～10% A；5～20 min，10%～30% A；20～30 min，30%～40%A；30～43 min，40% A；43～60 min，40%～100% A；60～65 min，100% A）；體積流量1 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長210 nm；進樣量30 μL。

2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間均值比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD 法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 不同黃芪屬植物醇提物對HepG2 細胞相對活力和葡萄糖消耗量的影響 與正常組比較，10 g／L 正品黃芪、梭果黃芪均能抑制細胞生長（P＜0.05，P＜0.01），10 g／L 云南黃芪也能抑制細胞生長，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與正常組比較，10 g／L 正品黃芪、梭果黃芪能降低標準化葡萄糖消耗量（P＜0.05），這可能是由于抑制了細胞生長所致，其余劑量黃芪醇提物對細胞的葡萄糖消耗均無明顯作用（P＞0.05），見表1。因此，采用1、0.1、0.01 g／L 的劑量進行后續(xù)實驗。

表1 不同黃芪屬植物醇提物對HepG2 細胞相對活力和葡萄糖消耗量的影響（±s， n＝8）

表1 不同黃芪屬植物醇提物對HepG2 細胞相對活力和葡萄糖消耗量的影響（±s， n＝8）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 胰島素抵抗模型的建立 與對照組（0 mol／L）比較，隨著胰島素孵育時間增加，較低濃度的胰島素能促進細胞增殖，其中1×10－8mol／L 胰島素孵育36 h 或48 h，1×10－6mol／L 胰島素孵育48 h 均能增加細胞相對活力（P＜0.01）。4 個濃度胰島素孵育不同時間均能一定程度地減少標準化葡萄糖消耗量（P＜0.05，P＜0.01），其中以1×10－6mol／L胰島素建立的胰島素抵抗模型最穩(wěn)定，且孵育36 h 后與對照組比較，葡萄糖消耗量差值最大（P＜0.01），見表2。因此，選擇1×10－6mol／L 胰島素孵育36 h 來誘導HepG2 細胞胰島素抵抗模型。

表2 不同濃度胰島素作用不同時間對HepG2 細胞相對活力和葡萄糖消耗量的影響（±s， n＝8）

表2 不同濃度胰島素作用不同時間對HepG2 細胞相對活力和葡萄糖消耗量的影響（±s， n＝8）

注：與同時間點對照組（0 mol／L）比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 不同黃芪屬植物醇提物對胰島素抵抗HepG2 細胞葡萄糖消耗量的影響 如表3 所示，與正常組比較，模型組細胞相對活力升高（P＜0.01），而標準化葡萄糖消耗量降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥吡格列酮組及1、0.1 g／L 正品黃芪組、1 g／L 梭果黃芪組、0.1 g／L 云南黃芪組均能增加標準化葡萄糖消耗量（P＜0.05，P＜0.01），說明以上藥物可以改善HepG2 細胞的胰島素抵抗。當劑量為1 g／L 時，增加標準化葡萄糖消耗量的能力為正品黃芪＞梭果黃芪＞云南黃芪；而當劑量為0.1 g／L時，云南黃芪＞正品黃芪＞梭果黃芪。此外，梭果黃芪能在模型的基礎上進一步促進細胞增殖。

表3 不同黃芪屬植物醇提物對胰島素抵抗HepG2 細胞葡萄糖消耗量的影響（±s， n＝8）

表3 不同黃芪屬植物醇提物對胰島素抵抗HepG2 細胞葡萄糖消耗量的影響（±s， n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 不同黃芪屬植物醇提物對胰島素抵抗HepG2 細胞內(nèi)已糖激酶活性的影響 與正常組比較，胰島素抵抗模型組細胞內(nèi)己糖激酶活性下降（P＜0.05）；與模型組比較，吡格列酮組、1 g／L 正品黃芪組和1 g／L 梭果黃芪組均能增加己糖激酶活性（P＜0.05，P＜0.01），其他劑量的3 種黃芪也有升高己糖激酶活性的作用，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。當劑量為1 g／L 時，增加己糖激酶活性的能力為正品黃芪＞梭果黃芪＞云南黃芪，見表4。

表4 不同黃芪屬植物醇提物對胰島素抵抗HepG2 細胞內(nèi)己糖激酶活性的影響（±s， n＝8）

表4 不同黃芪屬植物醇提物對胰島素抵抗HepG2 細胞內(nèi)己糖激酶活性的影響（±s， n＝8）

注：與正常組比較，＃ P ＜0.05；與模型組比較，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.5 不同黃芪屬植物醇提物對胰島素抵抗HepG2 細胞GLUT1、GLUT4 mRNA 表達的影響 如表5 所示，胰島素抵抗后，模型組GLUT1、GLUT4 mRNA 表達均較正常組下降（P＜0.01）；與模型組比較，吡格列酮組、正品黃芪組、梭果黃芪組和云南黃芪組均可增加GLUT1、GLUT4 mRNA 表達（P＜0.05，P＜0.01）。其中，梭果黃芪的作用最強；正品黃芪對GLUT1 mRNA 表達的作用稍強于云南黃芪，而對GLUT4 mRNA 表達的作用與云南黃芪相當。

表5 不同黃芪屬植物醇提物對胰島素抵抗HepG2 細胞GLUT1、 GLUT4 mRNA 表達的影響（±s， n＝3）

表5 不同黃芪屬植物醇提物對胰島素抵抗HepG2 細胞GLUT1、 GLUT4 mRNA 表達的影響（±s， n＝3）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.6 HPLC 化學成分分析 如圖1 所示，3 種黃芪的出峰情況有異同。在10～24 min 的大極性區(qū)間，3 種黃芪呈現(xiàn)的色譜峰類似而峰高（含量）有差異；在30～50 min 區(qū)間，3種黃芪樣品的色譜峰有差異性，表現(xiàn)為正品黃芪和梭果黃芪在30～35 min 有吸收峰，而云南黃芪在47 min 有吸收峰；當保留時間為58、60 min 時，3 種黃芪均有吸收峰，但是含量不同。

圖1 不同黃芪屬植物醇提物HPLC 色譜圖

4 討論

胰島素抵抗是指外周組織對胰島素利用不足［11］，對血糖的消耗量降低，是2 型糖尿病的顯著特征。過量胰島素誘導糖原合成的能力下降是導致胰島素抵抗的重要原因。葡糖糖轉運體、激酶磷酸化和糖原的儲存是調(diào)節(jié)胰島素介導糖原合成代謝的3 個主要控速步驟，可作為調(diào)控胰島素抵抗的主要靶標［12］。本研究表明，實驗所用劑量范圍內(nèi)的3 種黃芪不影響正常的葡萄糖消耗量，卻能增加高糖高胰島素誘導的葡萄糖消耗量，說明這些黃芪對胰島素抵抗均有一定的改善作用。同時，正品黃芪和梭果黃芪恢復己糖激酶活性和改善葡萄糖轉運體活性的能力較云南黃芪強。

在胰島素抵抗中，胰島素促進糖原合成和葡萄糖轉運的能力均下降。葡萄糖轉運蛋白（GLUT）介導了葡萄糖的跨膜轉運［13］，GLUT1 負責基礎條件下大部分組織中的葡萄糖攝?。?4］；GLUT4 在胰島素敏感組織中高表達［15］，胰島素刺激后，GLUT4 轉運葡萄糖的活性增強［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗發(fā)生后，2 種GLUT 的活性均下降；正品黃芪和梭果黃芪均能提高2 種GLUT 的活性，而云南黃芪主要增加GLUT4 的活性，說明正品黃芪和梭果黃芪能明顯改善胰島素抵抗發(fā)生后大部分組織的基礎血糖轉運和胰島素敏感組織的血糖吸收，而云南黃芪主要針對胰島素敏感組織的葡萄糖轉運。葡萄糖轉運入細胞后在己糖激酶的作用下生成6-磷酸-葡萄糖（G6P），促進細胞內(nèi)糖原合成或葡萄糖分解，而胰島素通過增強己糖激酶活性來降低血糖［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生胰島素抵抗的HepG2 細胞內(nèi)己糖激酶活性降低，使得胰島素作用減弱；正品黃芪和梭果黃芪能提高己糖激酶活性來改善胰島素抵抗，但云南黃芪無此作用。

3 種黃芪對胰島素抵抗作用靶點的區(qū)別可能與其所含化學成分種類和含量的差別有關。根據(jù)報道可知，正品黃芪中主要含有環(huán)阿屯烷型三萜皂苷類成分（如黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）、黃酮苷類成分（如黃酮、異黃酮）等［18-20］。課題組前期研究表明，梭果黃芪含有與正品黃芪類似的黃酮苷類成分（如毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷）和環(huán)阿屯烷型三萜皂苷類成分（如梭果黃芪苷A、B、C）等［8，10，21］，而云南黃芪中的成分大多為甾體類（如蒲公英甾醇、β-谷甾醇等甾體等）［9］。本研究通過HPLC 分析發(fā)現(xiàn)，3 種黃芪的化學成分既有類似也有區(qū)別，尤其是在保留時間30～50 min區(qū)間，正品黃芪和梭果黃芪出峰多，而云南黃芪出峰少。由于黃酮類成分含吸收強的共軛鍵，云南黃芪含的黃酮類成分可能少于另外2 種黃芪。

綜上所述，云南黃芪改善胰島素抵抗的作用要弱于正品黃芪和梭果黃芪，其中梭果黃芪表現(xiàn)出更好的治療糖尿病潛力。