■上官秉喆 武 琪 成采遙 何金川 郭 剛 霍文婕 王 聰 劉 強

（山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，山西太谷 030801）

泛酸（PA）和葉酸（FA）是反芻動物和瘤胃微生物必需的營養(yǎng)因子。PA 以輔酶A（CoA）和?；d體蛋白的形式參與碳水化合物、氨基酸和脂肪酸的代謝以及mRNA 的合成[1]。FA是一碳單位的載體，以5,10-亞甲基四氫葉酸、10-甲?；臍淙~酸和5-甲基四氫葉酸的形式參與DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，其中10-甲?；臍淙~酸合成嘌呤的過程需要泛酸化修飾才能被激活[2-3]。日糧中添加的PA 或FA 分別約78%或97%在瘤胃中被微生物降解或破壞，因此，成年反芻動物應(yīng)使用包被PA（CPA）或包被FA（CFA）添加劑[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，公牛日糧中添加CPA 或CFA，日增重（ADG）、日糧氮利用率和血液總蛋白濃度提高[6-7]，瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸濃度、主要纖維分解菌和淀粉分解菌數(shù)量增加[7-8]。補充CFA 公牛肝臟磷脂酰肌醇激酶（P13K）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和核糖體S6 激酶（P70S6K）mRNA 的表達量增加[7]。奶牛試驗發(fā)現(xiàn)，補充包括PA 和FA 的瘤胃保護B 族維生素，奶牛泌乳性能的改善可能與能量和蛋白質(zhì)代謝效率的提高有關(guān)[10]?；诂F(xiàn)有研究提出假設(shè)，補充PA 或FA 后，公牛ADG 的增加，可能與PA 或FA 對蛋白質(zhì)合成代謝的調(diào)控有關(guān)，且PA 和FA 共同添加比二者單獨添加對提高ADG 更有效。因此，試驗研究日糧中添加CPA 或/和CFA 對公牛生長性能、養(yǎng)分消化和肌肉組織蛋白質(zhì)合成代謝關(guān)鍵基因表達的影響，以期為B 族維生素在反芻動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用PA 和FA 由某公司生產(chǎn)，飼料級，純度99%。CPA 和CFA 由課題組依據(jù)Wang 等[9]的方法制備，CPA和CFA的瘤胃釋放率分別為30.4%和27.3%，小腸釋放率分別為64.6%和70.1%。

1.2 試驗動物與設(shè)計

選用90日齡、體重為（123.0±8.5）kg的中國荷斯坦公牛32頭，按照2×2因子設(shè)計，隨機分為4組：對照組（基礎(chǔ)日糧）、CPA組[基礎(chǔ)日糧+50 mg/kg干物質(zhì)（DM）CPA]、CFA組（基礎(chǔ)日糧+8.5 mg/kg DM CFA）與CPA+CFA 組（基礎(chǔ)日糧+50 mg/kg DM CPA+8.5 mg/kg DM CFA）。試驗期為80 d，包括預(yù)試期20 d 和正試期60 d。

1.3 試驗日糧與飼養(yǎng)管理

試驗日糧依據(jù)NRC（2001）[4]配制（見表1），試驗牛單欄飼養(yǎng)、自由飲水和采食，每日飼喂3次（07：00、14：00和19：00）。晨飼時，先將添加劑與少量精料混合后飼喂，待牛全部采食完畢后，再飼喂其他飼料。

表1 日糧組成和營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

1.4 樣品采集與分析

1.4.1 體重與采食量

正試期的第1天和第60天，晨飼前對每頭試驗牛稱重，計算ADG。記錄每頭牛每日飼喂量和剩料量，測定飼料和剩料的DM 含量，計算干物質(zhì)采食量（DMI）和料重比。

1.4.2 飼料樣和糞樣

正試期的第54～59 d，每天采集每頭牛所喂的飼料和剩料樣品；采用直腸取糞法收集每頭牛糞便樣品約300 g，每天4 次，每次間隔6 h，糞樣中加入占鮮糞重1/4 的10%酒石酸溶液。飼料、剩料和糞便樣品保存于-20 ℃，試驗結(jié)束后，分別以牛為單位按比例混勻，65 ℃烘干至恒重，粉碎（1 mm），依據(jù)實驗室常規(guī)方法[10]測定樣品中DM、有機物（OM）、蛋白質(zhì)（CP）、粗脂肪（EE）、酸性洗滌纖維（ADF）和中性洗滌纖維（NDF）的含量。

1.4.3 血液和肌肉樣品

正試期的第60 d，晨飼前，頸靜脈采集每頭牛血液樣品20 mL，3 000 r/min 離心15 min 以分離血清，-40 ℃保存。根據(jù)上海篤瑪生物有限公司生產(chǎn)的ELISA 試劑盒說明書，采用酶標儀（Synergy H1 酶標儀，美國伯騰儀器有限公司）測定血清中葡萄糖（Glu）、總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、泛酸（PA）、葉酸（FA）、同型半胱氨酸（Hcy）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的含量。采用體外穿刺技術(shù)采集每頭牛背最長肌樣品約0.5 g，-80 ℃保存。用相對定量PCR法測定肌肉樣品中IGF-1、胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）、PI3K、mTOR和P70S6K mRNA的表達。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)依據(jù)2×2 因子試驗設(shè)計，采用SAS 9.0統(tǒng)計軟件中的混合模型進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長性能

由表2 可知，日糧添加CPA 或CFA，DMI 無顯著變化（P＞0.05）；ADG 顯著增加（P＜0.05），料重比顯著降低（P＜0.05）。公牛ADG 和料重比，CPA 和CFA 互作效應(yīng)顯著（P＜0.05），公牛ADG，CPA+CFA 組最高，CPA 組和CFA 組次之，對照組最低；料重比，CPA+CFA組最低，CPA組和CFA組次之，對照組最高。

表2 包被泛酸和包被葉酸對公牛采食量、平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率的影響

2.2 日糧養(yǎng)分表觀消化率

由表3 可知，CPA 和CFA 的互作效應(yīng)不顯著（P＞0.05）。日糧添加CPA 或CFA，DM、OM、CP 和NDF 的表觀消化率顯著增加（P＜0.05），EE、ADF 的表觀消化率沒有顯著變化（P＞0.05），但ADF 的表觀消化率隨CFA的添加顯著增加（P＜0.05）。

表3 包被泛酸和包被葉酸對公牛養(yǎng)分表觀消化率的影響（%）

2.3 血液代謝產(chǎn)物

由表4可知，公牛血液TP含量，CPA和CFA的互作效應(yīng)顯著（P＜0.05），CFA組和CFA組顯著高于對照組（P＜0.05）。日糧添加CPA或CFA，血液Glu和IGF-1濃度顯著增加（P＜0.05）。日糧添加CPA，血液Alb、FA和Hcy濃度不變（P＞0.05），PA濃度顯著增加（P＜0.05）。日糧添加CFA，血液Alb和FA濃度顯著增加（P＜0.05），Hcy濃度顯著降低（P＜0.05），PA濃度無顯著變化（P＞0.05）。

表4 包被泛酸和包被葉酸對公牛血液代謝產(chǎn)物的影響

2.4 肌肉蛋白質(zhì)代謝基因表達

由表5可知，公牛肌肉組織蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 的表達，CPA 和CFA 的互作效應(yīng)不顯著（P＞0.05），且不受添加CPA 的影響（P＞0.05）。日糧添加CFA，顯著上調(diào)了肌肉組織中IGF-1、IGF-1R、PI3K、mTOR和P70S6K的表達（P＜0.05）。

表5 包被泛酸和包被葉酸對公牛背最長肌蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA表達的影響(拷貝數(shù)/mg)

3 討論

日糧補充CPA 對公牛的DMI 無顯著影響，因此，ADG 的提高和FCR 的降低與日糧養(yǎng)分表觀消化率和氮利用率的提高有關(guān)。血液TP和IGF-1濃度可作為反映日糧蛋白質(zhì)利用率的指標[12-13]。血液TP和IGF-1濃度的提高，表明添加CPA 可能改善了日糧氮利用率。另外，奶牛試驗發(fā)現(xiàn)，補充包括PA的瘤胃保護B族維生素，奶牛泌乳性能的提高可能與能量和蛋白質(zhì)代謝效率的提高有關(guān)[10]。PA 以CoA 的形式參與細胞的蛋白質(zhì)和能量代謝。肌肉組織IGF-1、IGF-1R、PI3K、mTOR 和P70S6K mRNA 表達量無顯著變化，表明添加CPA 對公牛肌肉蛋白質(zhì)合成代謝調(diào)控的影響不顯著。但是，添加CPA 后血液PA 和Glu 濃度的提高，表明公牛PA 的狀態(tài)改善，能量利用率可能提高，這也是ADG 增加的原因之一。而且，Liu 等[6-8]報道，公牛日糧添加CPA，氮利用率、血液TP 和PA 濃度提高，ADG 和飼料利用率提高。添加CPA，日糧DM、OM、CP 和NDF 表觀消化率提高，表明CPA 促進了養(yǎng)分在瘤胃和腸道的消化。消化道中一些種類的細菌和真菌可以合成PA，但是大部分微生物要依賴外源PA 的補充[14]。試驗發(fā)現(xiàn)，日糧中添加CPA，公牛瘤胃主要纖維分解菌和淀粉分解菌的數(shù)量增加，DM、CP和NDF 瘤胃降解率提高[8]；添加PA，雞腸道微生物數(shù)量增多[15]。前期研究同樣發(fā)現(xiàn)，補充CPA，公牛全消化道養(yǎng)分消化率提高[6，8]。

日糧添加CFA，公牛DMI無顯著變化，但是，ADG提高，料重比降低。試驗結(jié)果與日糧養(yǎng)分表觀消化率的提高相一致，與CFA 對蛋白質(zhì)合成代謝的調(diào)控有關(guān)。公牛血液TP、Alb 和IGF-1 濃度，以及肌肉組織IGF-1、IGF-1R、PI3K、mTOR 和P70S6K mRNA 表達量的提高表明，添加CFA可能促進了公牛肌肉蛋白質(zhì)的合成。血液FA 濃度提高、Hcy 濃度降低的結(jié)果進一步表明，添加的FA被有效吸收，參與了Hcy向蛋氨酸的轉(zhuǎn)化，參與了蛋白質(zhì)合成代謝的調(diào)控。FA 作為一碳單位的載體，參與DNA、RNA 和蛋氨酸的合成，Hcy 接受5-甲基四氫葉酸的甲基轉(zhuǎn)化為蛋氨酸[2]。IGF-1/PI3K/mTOR 是調(diào)控細胞生長和蛋白質(zhì)合成代謝的關(guān)鍵信號通路[15]。肌肉組織中，IGF-1和IGF-1R結(jié)合，刺激PI3K、mTOR 和P70S6K mRNA 的表達，進而促進蛋白質(zhì)的合成和動物生長[16]。其他研究同樣發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A 通過激活I(lǐng)GF-1/PI3K/mTOR 通路關(guān)鍵基因的表達，促進C1C12 細胞的分化和生長[17]；日糧添加CFA，公牛肝臟組織蛋白質(zhì)合成代謝關(guān)鍵基因mRNA的表達上調(diào)[7]。全消化道DM、OM、CP、NDF和ADF消化率提高的結(jié)果表明，添加CFA促進了瘤胃和瘤胃后養(yǎng)分的消化。FA是瘤胃微生物生長和纖維降解的必需營養(yǎng)因子[18]，能改善單胃動物小腸的結(jié)構(gòu)和功能[19]。Wang 等[9]同樣發(fā)現(xiàn)，肉牛日糧補充CFA，DM、CP 和NDF 在瘤胃和全消化道的消化率提高。體外試驗表明，補充FA，DM在瘤胃和全消化道的消化率提高[20]。

日糧養(yǎng)分表觀消化率和背最長肌蛋白質(zhì)代謝關(guān)鍵基因的表達，CPA 和CFA 互作效應(yīng)不顯著。因此，闡明公牛ADG和料重比存在顯著CPA和CFA正互作效應(yīng)的原因還需要進一步研究。血液TP 含量，CPA和CFA互作效應(yīng)顯著，CPA和CFA共同添加組與CPA或CFA單獨添加組無顯著差異。試驗結(jié)果表明，CPA的添加可能提高了FA的利用效率。研究發(fā)現(xiàn)，10-甲?；臍淙~酸合成嘌呤的過程需要泛酸化修飾才能被激活[3]。

4 結(jié)論

日糧中添加CPA 50 mg/kg DM 或者添加CFA 8.5 mg/kg DM，改善了公牛的生長性能和養(yǎng)分消化；CFA 上調(diào)了公牛肌肉組織蛋白質(zhì)合成代謝關(guān)鍵基因的表達；與單獨添加相比，CPA 和CFA 共同添加能進一步改善公牛生長性能。