■潘敏慧 黃小乘 田怡豪 孫占微 李成云，2，3*

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002；2.延邊大學(xué)肉?？茖W(xué)與產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，吉林延吉 133002；3.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，吉林延吉 133002）

柞樹(shù)（Xylosma racemosum），是殼斗科櫟屬植物的通稱，通常指的是蒙古櫟（Quercus mongolica Fisch.ex Ledeb）。蒙古櫟是我國(guó)落葉林的主要樹(shù)種組成之一，又稱蒙古柞，具有耐寒、耐干旱、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，在我國(guó)主要集中分布在東北部以及內(nèi)蒙古的東部地區(qū)[1-2]。柞樹(shù)具有節(jié)省土地、自然生長(zhǎng)、分布廣泛、成本低的優(yōu)點(diǎn)。柞樹(shù)經(jīng)過(guò)1～4 年生長(zhǎng)后，其葉子質(zhì)量較好。同時(shí)，我國(guó)的柞樹(shù)葉資源豐富，價(jià)格低廉且產(chǎn)量大。柞樹(shù)葉中富含礦物質(zhì)元素，以及多種以酮類、酯類化合物為主的揮發(fā)性化學(xué)成分，還含有多種不飽和脂肪酸，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較強(qiáng)的抗氧化活性[3-4]。已有研究表明，青貯柞樹(shù)葉的粗蛋白、粗脂肪含量都高于青貯玉米稈的含量，而粗纖維的含量卻比青貯玉米低。但將柞樹(shù)葉直接作為飼料飼喂不但適口性差，還會(huì)因其抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量過(guò)高，從而阻礙或者抑制畜禽對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收。單寧是柞樹(shù)葉中最主要、含量最高的抗?fàn)I養(yǎng)因子。若控制畜禽對(duì)縮合單寧的攝入量，可以有效提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能[5]和飼料利用率[6]。有研究結(jié)果表明，在青貯原料中添加植物乳酸菌和蔗糖，可以顯著降低單寧含量[7-8]。用石灰水浸泡法對(duì)柞樹(shù)葉進(jìn)行脫毒處理，脫毒效果佳，且對(duì)柞樹(shù)葉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值無(wú)不良影響[9]。青貯是牧草經(jīng)典的保存方法，但直接單獨(dú)青貯所得到的青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)不佳，可能會(huì)出現(xiàn)pH降低緩慢、乳酸菌含量低及可溶性碳水化合物（water soluable carbohydrate，WSC）含量不足等問(wèn)題，而在青貯時(shí)添加不同發(fā)酵添加劑可以有效改善其發(fā)酵品質(zhì)[10]。因此，本試驗(yàn)以柞樹(shù)葉作為原料，探討添加不同發(fā)酵添加劑[糖蜜、乳酸菌、EM菌（一種混合菌一般包括光合菌、酵母菌、乳酸菌等有益菌類，Effective Microorganisms，EM）、1%石灰水、乳酸菌加糖蜜及EM 菌加糖蜜]對(duì)青貯柞樹(shù)葉發(fā)酵品質(zhì)和微生物的影響，以期篩選出最佳的發(fā)酵添加劑，為青貯柞樹(shù)葉在反芻動(dòng)物中的合理利用提供科學(xué)依據(jù)，并為柞樹(shù)葉作為新型飼料資源在畜牧業(yè)中的應(yīng)用推廣打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

柞樹(shù)葉于2021年9月中旬，在延邊朝鮮族自治州草原管理站采集，化學(xué)成分見(jiàn)表1。糖蜜由某化學(xué)試劑有限公司提供，乳酸菌和EM 菌為延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室研制，1%石灰水由無(wú)水氫氧化鈣自行配制。

表1 柞樹(shù)葉的化學(xué)成分（% DM）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，未添加發(fā)酵添加劑組為對(duì)照組，其余6 組為試驗(yàn)組，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每千克柞樹(shù)葉中加入20 g 或1 mL 的添加劑，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 青貯飼料調(diào)制

將柞樹(shù)葉切至長(zhǎng)寬均為1～2 cm 的小塊，平均分成7組，將發(fā)酵添加劑按照比例分別均勻噴灑到各組柞樹(shù)葉上，而對(duì)照組噴灑等量純化水，均勻混合后分裝至30 cm×50 cm規(guī)格的聚乙烯真空密封袋中，密封后抽出其中氣體，按組貼好標(biāo)簽，放置在陰涼避光處，室溫（20.7±2.4）℃青貯60 d。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

青貯結(jié)束統(tǒng)一開(kāi)袋取樣，每組每個(gè)重復(fù)分別稱取樣品150 g，密封后包裝帶回，放在-20 ℃下儲(chǔ)存，用于青貯品質(zhì)及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.4.1 感官評(píng)定、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)

每袋重復(fù)稱取樣品50 g，按照德國(guó)農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)（DLG）的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[11]，見(jiàn)表3，對(duì)青貯柞樹(shù)葉的氣味、色澤和枝葉結(jié)構(gòu)進(jìn)行打分。

表3 青貯飼料感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

重復(fù)取1 g青貯柞樹(shù)葉，制成風(fēng)干樣，采用烘干法測(cè)定干物質(zhì)（DM）含量，用全自動(dòng)凱氏定氮儀（北京海鑫瑞科技有限公司）測(cè)定粗蛋白（CP）含量，采用索氏脂肪提取法測(cè)定粗脂肪（EE）含量，灰化法測(cè)定粗灰分（ASH）含量，Ca含量和P含量分別采用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法以及鉬黃分光光度法測(cè)定[12]。按照Van Soest[13]的方法進(jìn)行中性洗滌纖維含量（NDF）和酸性洗滌纖維含量（ADF）的測(cè)定。

稱取20 g青貯柞樹(shù)葉，加入180 mL純化水，常溫浸提24 h，用紗布過(guò)濾一遍后，用定性濾紙?jiān)俅芜^(guò)濾，獲得青貯浸提液，用于可溶性碳水化合物（WSC）和縮合單寧（CT）以及后續(xù)發(fā)酵品質(zhì)的測(cè)定?？扇苄蕴妓衔锊捎幂焱?硫酸比色法測(cè)定，縮合單寧采用香蘭素鹽酸法測(cè)定。

即時(shí)用賽多利斯PB-10酸度計(jì)（濟(jì)南愛(ài)來(lái)寶儀器設(shè)備有限公司）測(cè)定pH。氨態(tài)氮（NH3-N）含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法進(jìn)行測(cè)定[14]，用安捷倫GC-7890A 型色譜儀（杭州瑞析科技有限公司）測(cè)定有機(jī)酸中乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量[15]，用Flieg 評(píng)分法對(duì)青貯柞樹(shù)葉發(fā)酵品質(zhì)進(jìn)行整體評(píng)分[16]。

1.4.2 微生物測(cè)定

取出5 g 青貯樣品，加入45 mL 純化水稀釋，做10～109的濃度梯度。參照司丙文等[17]的方法，用稀釋平板涂布法測(cè)定菌落數(shù)量，好氧細(xì)菌、酵母菌與霉菌在37 ℃的有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，前者采用NA 培養(yǎng)基、后兩者采用PDA 培養(yǎng)基。乳酸菌在厭氧條件下，用MRS 瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后，用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行微生物含量的測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2010記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析，并采用LSD法對(duì)均值進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵添加劑對(duì)青貯柞樹(shù)葉感官評(píng)定和Flieg評(píng)分的影響

由表4可知，在氣味得分上各試驗(yàn)組均顯著高于CK 組（P＜0.05），且LW 組在各試驗(yàn)組中最低，試驗(yàn)組中僅LAB組和LAB-M組的質(zhì)地及得分與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05），且LAB 組與其他組別也存在顯著差異（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組的總分均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且等級(jí)均為優(yōu)良，說(shuō)明了試驗(yàn)組的青貯效果均優(yōu)于對(duì)照組。感官評(píng)定總分從高到低的排序?yàn)椋篍M-M 組＞LAB-M 組=EM 組＞LAB 組＞M組＞LW組＞CK組。

表4 不同發(fā)酵添加劑對(duì)青貯柞樹(shù)葉感官評(píng)定的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組中除LW組外的乳酸評(píng)分均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且EM-M組最高，并與其他組差異顯著（P＜0.05）。在乙酸評(píng)分中，除LW 組外其余試驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），EM-M 組顯著高于除LAB-M 組外的其余各組（P＜0.05）。各組均未檢測(cè)出丁酸，丁酸評(píng)分全為滿分。與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組中除LW組外的總分均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且EM-M 組最高，并與其他組差異顯著（P＜0.05）。Flieg評(píng)分總分從高到低的排序?yàn)椋篍M-M 組＞LAB-M 組＞M 組＞EM 組＞LAB 組＞LW組＞CK 組。除LW 組和CK 組等級(jí)為尚可外其余各組為優(yōu)。

表5 不同發(fā)酵添加劑對(duì)青貯柞樹(shù)葉Flieg評(píng)分的影響

2.2 不同發(fā)酵添加劑對(duì)青貯柞樹(shù)葉品質(zhì)的影響

由表6可知，各組均未檢測(cè)出丁酸。各試驗(yàn)組與CK組的pH差異顯著（P＜0.05），其中EM-M組的pH顯著低于其他組（P＜0.05）。EM-M 組的乳酸量最高，顯著高于其他組（P＜0.05）。各試驗(yàn)組之間丙酸含量差異不顯著（P＞0.05）。EM-M組的乳酸/乙酸值最高，且顯著高于其他組（P＜0.05）。除M組和LW組以外的其余試驗(yàn)組的NH3-N/TN值都顯著低于CK組（P＜0.05）。

表6 不同發(fā)酵添加劑對(duì)青貯柞樹(shù)葉pH、VFA和NH3-N/TN的影響

2.3 不同發(fā)酵添加劑對(duì)青貯柞樹(shù)葉營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表7 可知，與CK 組相比，M 組DM 含量較其他各組顯著降低（P＜0.05）；除LAB-M 組和LW 組外，其余各組間EE 含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）；各組之間的Ash、NDF 和ADF 含量差異不顯著（P＞0.05）；CK 組的可溶性碳水化合物僅和M 組的存在顯著差異（P＜0.05）；不同青貯添加劑顯著降低了柞樹(shù)葉青貯飼料的CT含量（P＜0.05）。

表7 不同發(fā)酵添加劑對(duì)青貯柞樹(shù)葉各成分的影響（%）

2.4 不同發(fā)酵添加劑對(duì)青貯柞樹(shù)葉微生物數(shù)量的影響

由表8可知，不同青貯添加劑顯著提高了柞樹(shù)葉青貯飼料的乳酸菌數(shù)量（P＜0.05），CK 組乳酸菌數(shù)量最低，除LAB 組和LAB-M 組外其余各組間乳酸菌數(shù)量差異顯著（P＜0.05）。除LAB 組和LW 組外其余試驗(yàn)組的酵母菌數(shù)量均顯著低于CK 組（P＜0.05），其中EM-M組的酵母菌數(shù)量最低。與CK組相比，除LW組外的其余試驗(yàn)組都顯著降低了霉菌數(shù)量（P＜0.05）。CK組和LW組好氧細(xì)菌數(shù)量最高。

表8 不同發(fā)酵添加劑對(duì)青貯柞樹(shù)葉微生物數(shù)量的影響(lg CFU/g)

3 討論

3.1 不同發(fā)酵添加劑對(duì)青貯柞樹(shù)葉品質(zhì)的影響

感官評(píng)定是青貯品質(zhì)鑒定中最直接的方法，本試驗(yàn)中發(fā)酵添加劑試驗(yàn)組的青貯感官評(píng)定等級(jí)均優(yōu)于CK 組，這與邵新慶等[18]的試驗(yàn)結(jié)果一致。青貯品質(zhì)的好壞也可以通過(guò)pH、有機(jī)酸含量和NH3-N/TN這些重要指標(biāo)來(lái)衡量。一般認(rèn)為優(yōu)質(zhì)青貯飼料的pH應(yīng)小于4.2，會(huì)抑制大部分微生物的生長(zhǎng)[19-20]。本試驗(yàn)中各組青貯柞樹(shù)葉的pH都低于4.1，達(dá)到了優(yōu)質(zhì)級(jí)別。同時(shí)LW組的青貯發(fā)酵pH最高，這與王馨等[21]的結(jié)論相反，這是因?yàn)槭宜蕪?qiáng)堿性，但其是否對(duì)青貯pH造成影響可能與其添加量有關(guān)。乳酸菌能夠直接利用的發(fā)酵底物是WSC，乳酸和乙酸的含量與WSC有關(guān)，WSC 含量越多產(chǎn)生的乳酸越多、乙酸越低，青貯發(fā)酵品質(zhì)越好[22]。適量的乙酸在青貯發(fā)酵初期可以起到抑制有害微生物繁殖的作用，過(guò)量的乙酸則會(huì)降低飼料適口性，影響采食量[23]。本試驗(yàn)中LAB-M組、LW組和EM-M組的乙酸含量均顯著低于CK組。丙酸酸性弱但具有強(qiáng)大的抗真菌活性，可以有效抑制霉菌生長(zhǎng)[24]。各試驗(yàn)組的丙酸含量較對(duì)照組有所升高，這與牟林林[25]的試驗(yàn)結(jié)果一致。

本試驗(yàn)中，各組青貯柞樹(shù)葉均未檢測(cè)出丁酸，這與王隆等[26]的研究結(jié)果一致。NH3-N/TN 也可以反映青貯效果，代表了青貯飼料中蛋白質(zhì)分解量，比值越大，青貯質(zhì)量越低[27]。說(shuō)明在青貯柞樹(shù)葉中添加除LW 外的發(fā)酵添加劑可以提高青貯品質(zhì)。由Flieg 評(píng)分的計(jì)算公式可知，F(xiàn)lieg 評(píng)分的結(jié)果與DM 和pH 有關(guān)，該試驗(yàn)中除M組外其余各組的DM含量無(wú)顯著差異，因此Flieg評(píng)分的變化規(guī)律與pH相差不大。

3.2 不同發(fā)酵添加劑對(duì)青貯柞樹(shù)葉營(yíng)養(yǎng)成分的影響

CP 含量是反映物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，其值越高，則表明可被利用的營(yíng)養(yǎng)成分越高，而NDF 與ADF 含量所反映的則剛好相反。ADF 和NDF 是評(píng)價(jià)纖維質(zhì)量最有效的指標(biāo)，它們含量越高則表明家畜消化率越低[28]。在本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)糖蜜添加組（M 組、LAB-M 組、EM-M 組）顯著提高了青貯柞樹(shù)葉的CP、WSC以及乳酸的含量，原因可能是：首先，糖蜜的添加直接提高了WSC 含量，進(jìn)一步提高了柞樹(shù)葉青貯中的WSC含量；其次，因WSC的提高使乳酸菌的數(shù)量在青貯早期有了很大的增加，縮短了青貯發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間，使其他雜菌對(duì)發(fā)酵底物和蛋白質(zhì)的消耗量減少[29]。這與毛一帆等[30]和吳金彩等[31]的研究結(jié)論一致。LW 組CT 含量有效降低，與呂竑建等[7]的試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.3 不同發(fā)酵添加劑對(duì)青貯柞樹(shù)葉中微生物數(shù)量的影響

青貯的品質(zhì)與其微生物數(shù)量息息相關(guān)，特別是乳酸菌具有決定性的作用。青貯早期的乳酸菌快速增殖是青貯成功的基礎(chǔ)，該過(guò)程產(chǎn)生大量乳酸，使pH迅速降低，抑制有害菌的繁殖，形成了有利于發(fā)酵的環(huán)境[32]。乳酸菌不但是降低青貯料pH 的主要菌種，還是保存青貯材料的主要菌種[33]。霉菌是致使青貯飼料腐敗變質(zhì)的主要因素，接觸空氣以及含水量特別高的飼料部分容易發(fā)生霉變，產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，導(dǎo)致飼料酸敗，影響動(dòng)物的采食量[34]。霉菌對(duì)青貯的品質(zhì)有不好的影響，目前可以通過(guò)降低pH和確保青貯處于非有氧環(huán)境來(lái)有效抑制霉菌生長(zhǎng)[35]。酵母菌和好氧細(xì)菌在有氧的條件下，會(huì)快速地生長(zhǎng)繁殖，將青貯飼料二次發(fā)酵，使其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低甚至腐敗變質(zhì)[36]，酵母也被認(rèn)為是青貯在開(kāi)始時(shí)就變質(zhì)的最重要的微生物因素。

4 結(jié)論

通過(guò)乳酸菌、蜜糖、EM 菌和1%的石灰水這4 種青貯添加劑的使用，前三者在一定程度上改善了青貯柞樹(shù)葉的品質(zhì)。綜合各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，各組青貯柞樹(shù)葉的綜合營(yíng)養(yǎng)價(jià)值從高到低依次為：EM-M 組＞LAB-M 組＞M 組＞EM 組＞LAB 組＞LW 組＞CK 組，即EM-M組提升青貯品質(zhì)的效果最優(yōu)。