全無瑕，繆延棟，米登海

擴(kuò)張型心肌病(DCM)是一種以左心室擴(kuò)張和收縮功能障礙為主要表現(xiàn)的非缺血性心肌疾病，編碼細(xì)胞骨架和核膜蛋白的基因突變占病例總數(shù)的35%，世界衛(wèi)生組織將擴(kuò)張型心肌病定義為嚴(yán)重的心臟紊亂，發(fā)病率和死亡率較高，也可導(dǎo)致心力衰竭和心律失常等并發(fā)癥的發(fā)生[1-3]。由于擴(kuò)張型心肌病有大量的基因和等位基因，基因診斷可以幫助預(yù)測預(yù)后，特別是某些亞型心律失常的風(fēng)險[4]。

中醫(yī)藥作為我國最受歡迎的補充和替代醫(yī)學(xué)模式之一，因其療效明顯、資源豐富、毒性低而逐漸被國際專家認(rèn)可，并在西方國家得到越來越多的應(yīng)用[5]。在擴(kuò)張型心肌病的臨床治療中，有許多中成藥和中藥注射劑單獨使用或作為常規(guī)化療的輔助手段[6-8]。芪藶強心膠囊主要由黃芪、人參、附子、丹參、葶藶子、澤瀉、玉竹、桂枝、紅花、香加皮、陳皮等組成，具有益氣溫陽、活血通絡(luò)、利水消腫之功效，適用于心力衰竭陽氣虛乏、絡(luò)瘀水停證的治療，在臨床治療心血管相關(guān)疾病方面取得很好的療效，并且是少數(shù)經(jīng)過嚴(yán)格、科學(xué)、客觀的臨床試驗評價進(jìn)入臨床指南的中成藥之一[9-11]。然而，該中成藥治療心臟病，特別是擴(kuò)張型心肌病的藥理過程和分子機制尚未得到詳細(xì)的闡述。因此，本研究采用生物信息學(xué)的方法，對芪藶強心膠囊治療擴(kuò)張型心肌病的化合物與生物學(xué)特征進(jìn)行初步分析，為該方進(jìn)一步的實驗研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

復(fù)方中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過整合系統(tǒng)生物學(xué)、高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)分析及網(wǎng)絡(luò)可視化等多種技術(shù)，揭示“疾病-基因-靶點-中藥”相互作用的復(fù)雜體系，系統(tǒng)性分析中藥對機體疾病的干預(yù)與影響[12]。通過中藥與中藥之間的化學(xué)結(jié)構(gòu)、功效等方面的相似性，結(jié)合機體靶點分子、生物學(xué)效應(yīng)的復(fù)雜相互作用關(guān)系，通過構(gòu)建藥物-化合物-靶標(biāo)等網(wǎng)絡(luò)，可有效預(yù)測藥物功能或特定功能所對應(yīng)的藥物，是目前現(xiàn)代中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重要手段之一[13]。分子對接技術(shù)是一種基于配體化合物與受體大分子三維結(jié)構(gòu)的結(jié)合作用，通過計算物理化學(xué)等參數(shù)評價二者間的相互作用，從而達(dá)到篩選輔助藥物的目的，現(xiàn)已廣泛用于基于特定靶標(biāo)的中藥及復(fù)方活性成分的研究[14]。

本研究利用復(fù)方中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法結(jié)合分子對接技術(shù)，以芪藶強心膠囊作為研究對象，對藥物治療靶點進(jìn)行發(fā)掘，通過構(gòu)建特定的“中藥活性成分-靶點-藥理”的復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，評價中藥的合理性和相容性。探究芪藶強心膠囊治療擴(kuò)張型心肌病的活性成分和潛在的靶基因以及基因相關(guān)的功能和介導(dǎo)的通路，從而進(jìn)一步闡明藥理作用及分子機制，為現(xiàn)代中藥的研究和開發(fā)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源 本研究采用公共數(shù)據(jù)庫與數(shù)據(jù)分析軟件，其中數(shù)據(jù)庫包括中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP，https：//tcmspw.com)[15]、靶點蛋白數(shù)據(jù)庫 UniProt(https：//www.uniprot.org)[16]、基因名片數(shù)據(jù)庫(GeneCards?：the human gene database，https：//www.genecards.org)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM?：online mendelian inheritance in man，https：//omim.org)[17]、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫(https：//www.pharmgkb.org)[18]、治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/)[19]、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(https：//go.drugbank.com/)[20]、String 網(wǎng)站(https：//string-db.org/)、小分子化合物結(jié)構(gòu)查詢數(shù)據(jù)庫PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[19]、RSCB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(protein data bank，PDB，https：//www.rcsb.org/)[21]。分析軟件包括網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲕浖?Cytoscape 3.8.0[22]、化學(xué)結(jié)構(gòu)繪圖分析軟件(ChemBio3D Ultra 14.0)、分子可視化系統(tǒng)軟件PyMOL 2.4.0、分子對接軟件AutoDock、Vina及數(shù)據(jù)分析軟件 R軟件3.6.2、Strawberry Perl-5.32.0.1及繪圖軟件GraphPad Prism 8。

1.2 方法

1.2.1 篩選芪藶強心膠囊中活性成分及靶點蛋白 通過TCMSP以芪藶強心膠囊中所含的11味中藥材(黃芪、人參、附子、丹參、葶藶子、澤瀉、玉竹、桂枝、紅花、香加皮、陳皮)為關(guān)鍵詞檢索其化學(xué)成分。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為指標(biāo)篩選各味藥中活性成分[12]，同時下載有效成分的人源靶點信息。通過 UniProt 數(shù)據(jù)庫查找相關(guān)靶標(biāo)蛋白的基因名，采用perl 語言將查詢到的靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)化為相應(yīng)基因簡稱。采用GraphPad Prism 8軟件繪制藥材中活性成分柱狀圖。

1.2.2 疾病靶點基因的篩選及“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 以擴(kuò)張型心肌病作為關(guān)鍵詞分別在GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD 以及DrugBank數(shù)據(jù)庫篩選出擴(kuò)張型心肌病相關(guān)的基因，通過R軟件利用R包“venn”，將疾病相關(guān)的基因以及藥物靶點基因取交集，獲得藥物靶點基因，然后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件中構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過String網(wǎng)站構(gòu)建藥物和疾病基因的蛋白互作(protein-protein interactive，PPI)網(wǎng)絡(luò)。然后使用CytoNCA 插件(2.1.6版)對這些節(jié)點的拓?fù)湓u分進(jìn)行綜合計算、評估和可視化分析，查找網(wǎng)絡(luò)核心基因，以中心度值(betweenness centrality，BC)、鄰近度值(closeness centrality，CC)、度值(degree centrality，DC)和特征向量值(eigenvector centrality，EC)、局部平均連通性(LAC)及網(wǎng)絡(luò)值(network centrality，NC)作為篩選項目。

1.2.3 靶點基因功能注釋與通路分析 功能注釋主要通過基因本體分析(gene ontology，GO)，分為生物過程(biological processes，BP)、細(xì)胞組成(cellular components，CC)或分子功能(molecular functions，MF)3類。京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)揭示已鑒定基因的生物信息及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。為了探究藥物和疾病靶點基因的功能與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過R軟件利用R包“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”和“ggplot2”進(jìn)行靶基因的GO功能注釋、KEGG信號通路富集分析以及可視化。

1.2.4 “活性成分-靶點” 的分子對接 首先，在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載PPI網(wǎng)絡(luò)中最核心基因JUN和TP53相關(guān)聯(lián)的活性成分化合物的2D結(jié)構(gòu)，保存為sdf格式文件，采用ChemBio3D Ultra 14.0轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行能量優(yōu)化，保存為mol2格式文件。其次，從RSCB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)中下載JUN的晶體復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)(PDB ID：5FV8)和TP53(PDB ID：7BWN)的晶體復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)用于分子對接研究，保存為pdb格式文件。運用PyMOL 2.4.0軟件對靶點蛋白進(jìn)行修飾，移除其中的水分子和小分子配體，保存為pdbqt格式文件。并利用AutoDock軟件對JUN和TP53的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫并保存為pdbqt格式文件，同時將活性成分化合物的格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式文件，確定活性口袋，并保留參數(shù)。最后，運用vina軟件完成分子對接，結(jié)合能小于0說明受體與配體間可以自發(fā)結(jié)合，研究選取結(jié)合能≤-20.9 kJ/mol 的活性成分作為芪藶強心膠囊治療擴(kuò)張型心肌病靶點的篩選依據(jù)[12]。

2 結(jié) 果

2.1 中藥活性成分的篩選 通過TCMSP共獲得芪藶強心膠囊中11味中藥的化合物共1 271種，其中，丹參202種，紅花189種，人參190種，附子65種，黃芪87種，香加皮79種，葶藶子68種，澤瀉46種，玉竹62種，桂枝220種，陳皮63種。在這些成分中，209種(16.44%)成分OB≥30%且DL≥0.18。其中，丹參65種，紅花22種，人參22種，附子21種，黃芪20種，香加皮17種，葶藶子12種，澤瀉10種，玉竹8種，桂枝7種，陳皮5種。芪藶強心膠囊中部分化合物基本信息見表1。

表1 芪藶強心膠囊中部分活性成分及化合物的基本信息

(續(xù)表)

2.2 篩選中藥與疾病靶點基因 共獲得3 322個擴(kuò)張型心肌病相關(guān)基因，各數(shù)據(jù)庫中的基因數(shù)量見圖1。與中藥靶點基因取交集，共獲得161個藥物-疾病靶點基因(見圖2)。

圖1 各數(shù)據(jù)庫篩選擴(kuò)張型心肌病相關(guān)基因數(shù)

圖2 中藥與疾病靶點基因

2.3 “中藥-活性成分-靶點” 相互作用網(wǎng)絡(luò) 在本研究中，首先構(gòu)建了芪藶強心膠囊活性成分和擴(kuò)張型心肌病靶基因之間的復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(見圖3)，藍(lán)色矩形代表靶點基因，圓形模塊表示中藥活性成分，該網(wǎng)絡(luò)由291個節(jié)點組成，其中，圓形130個節(jié)點是中藥生物活性成分，外周161個節(jié)點是靶點基因。除MOL000296(常春藤素)、MOL000449(豆甾醇)、MOL000098(槲皮素)、MOL000354(異鼠李素)、MOL000422(山柰酚)、MOL000358(β-谷甾醇)、MOL000006(木犀草素)、MOL000359(谷甾醇)分別來源于多種中藥外，其余生物活性分成均來自單一中藥，由于靶點眾多，選取最關(guān)鍵的部分進(jìn)行可視化。丹參、紅花、人參、黃芪、香加皮這5味中藥的活性成分最多，尤其是丹參，是該組方中的最關(guān)鍵藥物，130個生物活性成分中54個來源于丹參。161個靶點基因通過String網(wǎng)站構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)=0.9)，見圖4。隨后導(dǎo)入Cytoscape軟件，采用 CytoNCA插件，以BC、CC、DC、EC、LAC 及NC作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，首先獲得139個節(jié)點和685條邊的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(見圖5)，其中一個節(jié)點的度值代表網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點連接的路線數(shù)目。在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)按照上述標(biāo)準(zhǔn)獲得45個節(jié)點和294條邊的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(見圖6)。最后再次進(jìn)行篩選，獲得15個節(jié)點和74條邊的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(見圖7)。綜合上述篩選指標(biāo)，獲得排名前2位的靶點蛋白是JUN和TP53。

圖3 中藥活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 161個靶點基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 139個基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 45個基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 15個核心基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO功能注釋和KEGG通路分析 為了詳細(xì)了解上述靶點基因的生物學(xué)特性，采用R軟件，以基因數(shù)目≥3和錯誤發(fā)生率(FDR)<0.001作為篩選值對上述161個靶點基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。

2.4.1 GO功能注釋分析 GO功能注釋分析獲得1 180個BP條目，其中，46個條目涉及CC，70個條目涉及MF。主要涉及毒物質(zhì)、脂多糖、營養(yǎng)水平、細(xì)胞外刺激、金屬離子等與心肌細(xì)胞損傷相關(guān)的生物作用。前25條通路以及所參與調(diào)控的基因見圖8。GO富集分析中BP、CC、MF 前10位的基因條目見圖9。

圖8 GO功能注釋分析前25條通路及靶點

圖9 GO富集分析中BP、CC和MF排名前10位的基因

2.4.2 KEGG通路分析 KEGG通路分析獲得174條信號通路(P<0.05)，涉及人巨細(xì)胞病毒感染(參與基因主要包括PTGS2、RELA、AKT1、MAPK3、MAPK1等)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(參與基因主要包括RELA、AKT1、BCL2、MAPK3、MAPK1等)、流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化(參與基因主要包括RELA、AKT1、BCL2、GSTP1、MMP9、JUN、TP53等)、乙型肝炎(參與基因主要包括RELA、AKT1、BCL2、MAPK3、MAPK1等)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等通路(參與基因主要包括PTGS2、RELA、AKT1、MAPK3、MAPK1等)。選取P值較小的前30個通路進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖10。

圖10 KEGG通路分析排名前30位的信號通路

2.5 芪藶強心膠囊核心化合物作用與JUN和TP53的分子對接 一般認(rèn)為受體與配體相互作用的親和力越強，所需要的能量越少，其發(fā)生作用的可能性越大。將芪藶強心膠囊在“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)中的中心度值、親中心度值及等級值綜合排名前2位的靶點蛋白分別與藥物中的核心化合物進(jìn)行分子對接，結(jié)果見表2。這些化合物與兩個基因之間的親和能均<-20.9 kJ/mol，表明芪藶強心膠囊中的核心活性化合物與這兩個基因均有非常好的結(jié)合活性。其中，與JUN親和能較低的化合物分別為β-胡蘿卜素(親和能為-33.44 kJ/mol)、丹參酮Ⅱa(親和能為-30.10 kJ/mol)和木犀草素(親和能為-28.01 kJ/mol)。這些化合物與 TP53 的親和能較低的化合物分別為丹參酮Ⅱa(親和能為-39.29 kJ/mol)、槲皮素(親和能為-37.20 kJ/mol)和黃芩素(親和能為-35.95 kJ/mol)。此外，與兩個蛋白之間親和結(jié)合能較低的化合物還包括川陳皮素、β-谷甾醇、山柰酚和芒柄花黃素，為了進(jìn)一步研究這些化合物與蛋白之間的相互作用，對這 9 個化合物與蛋白之間的相互作用進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果見圖11、圖12。

表2 芪藶強心膠囊核心化合物與JUN、TP53 的結(jié)合親和力

圖11 芪藶強心膠囊中核心化合物與JUN的分子對接圖

圖12 芪藶強心膠囊中核心化合物與TP53的分子對接圖

3 討 論

擴(kuò)張型心肌病以慢性心力衰竭為主要臨床表現(xiàn)，中醫(yī)證候特征為虛實夾雜、本虛標(biāo)實[23]。心力衰竭在中醫(yī)中歸于“心悸”“水腫”“喘證”等范疇，其發(fā)病機制為心腎陽虛、心氣不足引起痰瘀水泛，在中醫(yī)臨床治療上應(yīng)著重關(guān)注活血利水、益氣溫陽[24]。

芪藶強心膠囊為基于絡(luò)病學(xué)脈絡(luò)瘀阻、氣陽虧虛、水液停聚、絡(luò)息成積的基本病機研發(fā)的中藥復(fù)方制劑，組方中丹參、紅花活血祛瘀、通經(jīng)止痛；人參補元氣；附子溫陽；黃芪補氣升陽、利水消腫；桂枝溫陽化軟；陳皮理氣健脾、燥濕化痰；玉竹養(yǎng)陰潤燥；澤瀉、葶藶子、香加皮等有利水消腫之效。諸藥合用，共奏活血祛瘀、益氣溫陽、活血利水的功效[25]?，F(xiàn)代藥理研究表明，芪藶強心膠囊可以抑制神經(jīng)內(nèi)分泌的過度激活、保護(hù)血管內(nèi)皮、阻斷離子通道、改善心室重構(gòu)及代謝重構(gòu)[26]。因此，本研究采用中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)，進(jìn)一步對芪藶強心膠囊治療擴(kuò)張型心肌病中潛在的活性成分及靶點進(jìn)行挖掘，并探討其可能的作用機制。

中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示，芪藶強心膠囊中主要的活性成分包括常春藤皂苷、豆甾醇、槲皮素、異鼠李素、山柰酚、β-谷甾醇、丹參酮Ⅱa、木犀草素、谷甾醇、芒柄花黃素等。劉佳慰等[27]研究發(fā)現(xiàn)，常春藤皂苷具有一定的降脂作用。槲皮素能夠有效地緩解自身免疫性心肌炎癥狀[28]。丹參酮Ⅱa、芒柄花黃素可以提高缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞的存活率以及ATP的含量，同時還可抑制動脈粥樣硬化性單核細(xì)胞黏附和炎癥，影響PPAR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)等[29-30]。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，能夠持續(xù)降低心肌梗死病人的血清β-脂蛋白和膽固醇水平[31]。異鼠李素同樣對心肌細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用[32]。另外，山柰酚可以通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激從而減輕心臟損傷[33]。結(jié)合文獻(xiàn)及本研究結(jié)果，說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在中醫(yī)藥作用機制鑒定中的成功實踐。同時，本研究中還有一些活性成分的心肌細(xì)胞保護(hù)作用尚未見報道，值得進(jìn)一步探究。其次，通過分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的靶點基因，最終發(fā)現(xiàn)靶點基因PTGS2與高度值節(jié)點JUN和TP53最為關(guān)鍵。研究表明，AP-1轉(zhuǎn)錄因子JUN可防止應(yīng)激所致的心臟適應(yīng)性不良重塑[34]。擴(kuò)張型心肌病的小鼠模型中PTGS2水平上升[35]。研究已證實，擴(kuò)張型心肌病病人的心臟組織中纖維化增加并且TP53信號通路激活[36]。TP53基因缺失部分挽救心肌纖維化、細(xì)胞凋亡、非心肌細(xì)胞增殖、左心室擴(kuò)張和功能障礙，并可以輕微改善擴(kuò)張型心肌病的存活率[37]。結(jié)合現(xiàn)有的報道與GO富集和KEGG分析結(jié)果顯示，與擴(kuò)張型心肌病相關(guān)的生物學(xué)過程主要有毒性反應(yīng)、脂多糖、細(xì)胞外刺激、金屬離子，細(xì)菌反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等，信號通路主要有人巨細(xì)胞病毒感染、流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、PI3K/Akt、MAPK、TNF等，涉及有毒物質(zhì)、病毒、重金屬、細(xì)菌、免疫調(diào)節(jié)及炎癥等多方面的生物學(xué)效應(yīng)，這與擴(kuò)張型心肌病的發(fā)病原因基本一致[2]。芪藶強心膠囊中主要的活性成分分別與JUN和TP53蛋白進(jìn)行分子對接，顯示其結(jié)合能力強，表明芪藶強心膠囊治療擴(kuò)張型心肌病中的心肌保護(hù)作用主要通過活性成分作用于上述基因，參與調(diào)控相關(guān)信號通路，從而發(fā)揮重要作用，而進(jìn)一步研究其詳細(xì)的藥理機制仍需相關(guān)實驗研究進(jìn)一步探討與證實。

綜上所述，本研究基于中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)，以芪藶強心膠囊為研究對象，對其所含的化學(xué)成分、作用靶點及其關(guān)鍵藥效成分與JUN和TP53的結(jié)合能力進(jìn)行分析，進(jìn)一步探索了芪藶強心膠囊治療擴(kuò)張型心肌病的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。本研究可以為進(jìn)一步針對中藥活性成分開展研發(fā)擴(kuò)張型心肌病中藥的篩選和評價提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。