莫 凡,李丹青,楊英捷△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)教研室,貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,貴州 貴陽 550000)

婦科腫瘤是威脅女性身體健康的主要疾病,全球腫瘤統(tǒng)計報告顯示,2020年全球婦科惡性腫瘤的新發(fā)病人數(shù)超過139.8萬,病死人數(shù)高達67萬,給女性健康和社會帶來了沉重負擔[1]。因此,不斷探索婦科腫瘤其發(fā)病機制,靶點藥物研發(fā)是亟待解決的關(guān)鍵問題。在維持細胞蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)中泛素化與去泛素化修飾為兩種重要方式,而蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡被破壞是許多細胞功能異常和諸多疾病如腫瘤發(fā)生的表征及起因。泛素羧基末端水解酶家族(ubiquitin C-terminal hydrolases,UCHs)它是去泛素化酶(deubiquitinases, DUBs)的主要成分之一。人類UCHs亞家族成員主要有4個,分別是UCH-L1、UCH-L3、UCH-L5(又稱為UCH37)和BRCA1相關(guān)蛋白(BAP1)。對比GTEx數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫的癌基因組,UCH-L5的突變量要遠高于UCH-L1和UCH-L3,這提示在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中,UCH-L5可能發(fā)揮著更主要的作用[2]。本文將綜述UCH-L5的結(jié)構(gòu)、功能及在婦科惡性腫瘤方面的研究進展。

1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)

泛素(ubiquitin)廣泛分布于真核生物中,它是由76個氨基酸組成、分子量約為8.5 kDa的一類在進化上非常保守且具有蛋白質(zhì)翻譯后修飾功能的小蛋白分子[3]。1975年泛素被Goldstein等最先發(fā)現(xiàn),在之后的十余年中進一步被證實。其羧基端會通過異肽鍵結(jié)合到底物蛋白的賴氨酸殘基上,稱為泛素化修飾。泛素化修飾的過程由一系列酶促級聯(lián)反應(yīng)進行催化完成,涉及的酶主要包括:泛素激活酶E1、泛素耦聯(lián)酶E2 及泛素連接酶E3。首先在ATP的參與下,E1與泛素C末端耦聯(lián)形成高能磷酸鍵,泛素被激活;活化后的泛素被轉(zhuǎn)移到E2活性半胱氨酸殘基上,而E3則將結(jié)合E2的泛素連接到靶蛋白尾端形成一小段泛素分子鏈。而26S蛋白酶體可特異性的識別帶有泛素標記的蛋白,并將其降解,泛素則釋放而被回收[4]。泛素-蛋白酶降解系統(tǒng)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的重要途徑之一,主要負責(zé)降解細胞內(nèi)的超過80%正?；虍惓５鞍踪|(zhì)。介導(dǎo)細胞內(nèi)多種生理過程調(diào)控,如DNA轉(zhuǎn)錄和修復(fù)、核糖體生成、離子通道、細胞凋亡等,它的異常也將會導(dǎo)致人類嚴重的疾病。

2 去泛素化酶概述

泛素化調(diào)節(jié)過程高度可逆,且具有較強的特異性,多種去泛素化酶分布于細胞內(nèi),可以切開泛素與賴氨酸或泛素與蛋白質(zhì)N端甲硫氨酸的鏈接,將泛素從底物蛋白上去除并游離多泛素鏈形成單泛素鏈,從而拮抗泛素化修飾的作用并回收利用泛素分子,阻止靶蛋白被過度降解。去泛素化酶參與許多生物學(xué)過程,如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生長、分化及腫瘤發(fā)生等[5]。據(jù)估計,去泛素化酶(DUBs)家族在人類細胞中有大約100個,由7 個家族組成,分別是泛素羧基末端水解酶(UCHs)、卵巢腫瘤蛋白酶(OTUs)、Machado-Josephin 結(jié)構(gòu)域的蛋白酶(MJDs)、單核細胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白(MCPIPs)、泛素特異性蛋白酶(USPs)、JAMM/MPN結(jié)構(gòu)域相關(guān)的金屬多肽酶(JAMMs)、以及最新發(fā)現(xiàn)的鋅指UFM1特異性多肽酶結(jié)構(gòu)域蛋白(ZUFSP)。目前為止發(fā)現(xiàn)的人類UCHs亞家族成員主要有4個,分別是UCH-L1、UCH-L3、UCH-L5/UCH37和BRCA1相關(guān)蛋白(BAP1)。它們的特點是都具有一個約由230個氨基酸組成的催化核心結(jié)構(gòu)域(稱UCH -結(jié)構(gòu)域)。晶體結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果顯示,UCH-結(jié)構(gòu)域含有三個保守的殘基:半胱氨酸、組氨酸和天冬氨酸。UCHs含有一個活性位點交叉環(huán),交叉環(huán)的大小限制了底物大小,因此,UCHs傾向于從泛素的C端切割相對較小的蛋白質(zhì)底物[6]。

3 UCH-L5的結(jié)構(gòu)與功能

UCH-L5結(jié)構(gòu)全長包含329個氨基酸,在序列上與UCH-L1、UCH-L3具有高度同源性,包含一個N末端UCH結(jié)構(gòu)域(殘基1～226)及一個延伸的C末端尾部(殘基227～329),研究發(fā)現(xiàn),UCH-L5的C末端存在一段獨特的氨基酸序列,稱為KEKE模序,從而在蛋白質(zhì)性質(zhì)和功能上與前二者存在一定差異[6]。研究顯示UCH-L5的晶體結(jié)構(gòu)由一個中心六鏈反平行結(jié)構(gòu)片組成,在片的兩側(cè)各有七個螺旋鏈,形成雙葉結(jié)構(gòu)。左葉催化殘基His164和Asp179分別位于3號鏈和4號鏈的氨基末端和羧基末端。右葉催化位點殘基Cys88Ala位于Helix4的氨基末端。UCH-L5的活性部位位于兩葉間的中心裂隙處。三個殘基(半胱氨酸、組氨酸和天冬氨酸)組成了木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶家族特有的催化三聯(lián)體。

UCH-L5溶解狀態(tài)時,常呈二聚體或四聚體形式,C末端結(jié)構(gòu)域相互覆蓋并阻礙其與泛素的結(jié)合,功能上處自抑制狀態(tài)。UCH-L5主要通過26S蛋白酶體和INO80染色質(zhì)重塑復(fù)合體發(fā)揮其功能。非ATP酶調(diào)節(jié)亞基13(Rpn13)又稱黏附調(diào)節(jié)分子1(ADRM1),是26S蛋白酶體的一個亞基,其N末端與多聚泛素鏈結(jié)合,而C末端也含有KEKE模序。UCH-L5與Rpn13通過各自的KEKE模序相連接,使UCH-L5自抑制解除,并招募到蛋白酶體中,分解多聚泛素鏈,從而阻止靶蛋白的降解[7]。Song等[8]研究表明細胞中蛋白體多聚支鏈泛素(Ub)聚合物,可激活UCH-L5(UCH37)活性,直接結(jié)合支鏈Ub的遠端疏水部分,通過Rpn13招募UCH-L5到蛋白體結(jié)合支鏈Ub和去泛素化增強并增加蛋白酶體對底物的清除作用,缺少UCH-L5會影響Ub的再循環(huán),影響下一輪的降解過程。

而UCH-L5與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的INO80結(jié)合則是通過核因子相關(guān)KB結(jié)合蛋白(NFRKB)。NFRKB是INO80復(fù)合物的一個亞基,與Rpn13不同的是,UCH-L5與NFRKB結(jié)合后,其活性進一步受到抑制。造成這種不同的原因在于Rpn13和NFRKB各自與UCH-L5 UCH結(jié)構(gòu)域的相互作用不同。NFRKB與UCH-L5結(jié)合的同時,其F100環(huán)結(jié)構(gòu)阻擋了UCH-L5的泛素結(jié)合位點并使UCH-L5的活性位點受到扭曲從而失去活性[9]。然而,在遇到Rpn13或26S蛋白酶體時,UCH-L5可重新被激活。目前UCH-L5在高級真核生物INO80復(fù)合物中的作用以及INO80復(fù)合體與蛋白酶體之間存在何種功能上的聯(lián)系,仍有待進一步研究。

4 UCH-L5與婦科惡性腫瘤

DUBs作用的靶蛋白包含轉(zhuǎn)錄因子、信號傳導(dǎo)分子等,而其中有些已經(jīng)證實是促癌因子或是抑癌因子,如P53、TGF-β、EGFR、Wnt等,從而調(diào)控細胞生物學(xué)進程,如細胞周期、凋亡等,來影響癌癥的發(fā)生[10]。在腫瘤不同類型的發(fā)生發(fā)展中,各DUBs發(fā)揮的作用不同:如UCH-L1、UCH-L3和UCH-L5多扮演促瘤因素的角色,而BAP1在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[11]。

4.1 UCH-L5與宮頸癌宮頸癌是女性惡性腫瘤中發(fā)病率及病死率最高的疾病之一,雖然宮頸癌早期篩查技術(shù)普及和治療手段的提升,預(yù)后得到了顯著的改善,但是,根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù),每年仍然超過50萬的新發(fā)病例。靶向治療可以通過標志物的表達針對性的進行治療,這也是近年來最有潛力的治療方式。因此對于宮頸癌潛在治療靶點的尋找,對改善宮頸癌患者預(yù)后有著重要臨床意義。

人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染和宮頸癌的發(fā)生存在顯著的關(guān)系。高風(fēng)險HPV(如HPV16、HPV18)感染后,通過三個步驟來啟動癌癥的發(fā)生發(fā)展:病毒DNA整合到宿主基因組,病毒癌蛋白(E6和E7)在上皮細胞中表達,以及病毒癌蛋白與細胞蛋白相互作用。眾所周知的致癌模型是,HPV表達癌蛋白E6和E7,E6與E6相關(guān)蛋白(E6-AP)結(jié)合后,促使抑癌蛋白P53通過泛素-蛋白酶體途徑降解,E6-AP也是E6 蛋白激活端粒酶的活性調(diào)節(jié)者與宮頸癌的進展密切相關(guān)[12];E7則通過泛素-蛋白酶體途徑使qRb失活降解,將分化細胞保留在DNA合成狀態(tài),中斷細胞周期控制并啟動基因轉(zhuǎn)錄[13]。E6和E7與大量細胞蛋白發(fā)生互相作用,而這些蛋白參與了細胞惡性表型的發(fā)展,其中一個重要的蛋白為β-catenin[14]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵成分,主要參與細胞-細胞黏附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Wnt信號在未激活時,胞漿中β-catenin一部分與胞膜上的鈣粘蛋白(E-caderin)相結(jié)合,一部分則與細胞質(zhì)內(nèi)Axin、APC和糖原合酶激酶3β(GSK3β)形成的降解復(fù)合體結(jié)合而被磷酸化,磷酸化的β-catenin被泛素連接酶E3識別,最終通過泛素化修飾被降解。在Wnt信號激活時,胞質(zhì)中的Dsh蛋白被招募至胞膜下,使GSK3β磷酸化失活,β-catenin不能被降解而聚集,進入細胞核內(nèi)結(jié)合TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族,啟動Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄[15]。β-catenin過度積累會引起Wnt/β-catenin信號的過度激活,從而導(dǎo)致腫瘤形成,促進腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此,保證細胞質(zhì)中的游離態(tài)β-catenin正常降解是維持著細胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵[16]。Rolén等人對比了宮頸癌患者的癌組織和鄰近正常組織的多種去泛素化酶水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織的UCH-L5水平顯著高于鄰近正常組織[17]。將UCH-L5水平與患者臨床病理特征進行相關(guān)分析,也表明UCH-L5的表達水平與宮頸癌患者FIGO分期及淋巴轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)[18]。采用CRISPR/Cas9 敲除宮頸癌Hela細胞的UCH-L5,發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)Rpn13水平顯著下降,泛素化的β-catenin水平升高,β-catenin降解過程顯著加快[19],這說明宮頸癌的發(fā)生可能與UCH-L5的增高使β-catenin泛素化降解減少,游離態(tài)β-catenin堆積,從而過度激活Wnt/β-catenin信號有關(guān)。

至今已發(fā)現(xiàn)數(shù)十種Wnt/β-catenin靶基因,如c-Myc、FOXOs、Smad、Oct4等與細胞增殖調(diào)控基因、發(fā)育控制基因和腫瘤發(fā)生相關(guān)的原癌基因、細胞周期蛋白D1、MMP7及血管內(nèi)皮生長因子等,在結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌、胃癌等多種癌癥中均顯示出重要意義[20]。對Wnt/β-catenin信號通路的核內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程進一步研究后發(fā)現(xiàn),UCH-L5敲除主要抑制了Wnt信號靶基因siamois和Xnr3的表達;同時,下游基因如c-Myc和Cyclin D1的表達也顯著下降,從而抑制了腫瘤細胞的遷移和增殖[19,21],WonheeHan等[22]觀察到不同的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)宮頸癌Hela細胞中UCH-L5以劑量依賴的方式抑制Wnt信號靶基因,如Axin1和c-myc的表達,降低活性βcatenin的水平,負調(diào)控βcatenin上游的Wnt信號通路。但并未觀察到在UCH-L5缺失條件下Wnt信號通路過度激活導(dǎo)致更具侵襲性的癌癥進展,且下調(diào)UCH-L5雖然促進了Wnt信號的活性,但卻抑制了癌細胞的生長。焦圣元等[23]研究表明,缺氧刺激可通過誘導(dǎo)HIF-1a的表達,進而激活UCH-L5表達增強,增強Hela細胞的增殖能力,從而降低了細胞的輻射敏感性,這表明UCH-L5可以促進宮頸癌的輻射抗性,靶向缺氧誘導(dǎo)UCH-L5的特異性抑制劑可能成為一種潛在放療增敏劑。而沉默Hela細胞的UCH-L5,可使其細胞周期停滯于G1期[18]。這表明UCH-L5的表達不僅可誘發(fā)宮頸癌腫瘤的發(fā)生,還可能是部分宮頸癌放射治療耐受的重要機制之一。

4.2 UCH-L5與卵巢癌卵巢癌因其臨床癥狀常不典型,大多數(shù)患者確診時已屬于晚期。目前,卵巢癌發(fā)病機制尚不明確。上皮性卵巢癌約占所有卵巢癌的80%,雖然目前有手術(shù)、化療、放療等治療手段, III、IV期的上皮性卵巢癌患者的預(yù)后仍較差。

Wang等通過用免疫印跡法檢測UCH-L5在卵巢癌組織和正常組織中的表達水平。并對卵巢癌患者的腫瘤標本中UCH-L5的表達與預(yù)后的關(guān)系進行了分析發(fā)現(xiàn)UCH-L5在大多數(shù)腫瘤組織中表達上調(diào),且UCH-L5的表達水平與腫瘤分化程度呈反比。同時,UCH-L5水平較高的患者總體生存期(OS)和無病生存期(DFS)顯著短于UCH-L5水平低的患者[24]。對來自cBioportal數(shù)據(jù)庫的多種癌癥基因組進行分析,結(jié)果顯示UCH-L5的基因變異非常頻繁,尤其是乳腺癌和高級別漿液性卵巢癌。使用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫進行分析,同樣也表明高級別漿液性卵巢癌患者1q31.1-1q31.2染色體上存在UCH-L5基因擴增子,且UCH-L5的拷貝數(shù)與其mRNA的表達水平也顯著相關(guān)。UCH-L5 mRNA表達水平與卵巢癌患者無進展生存(PFS)較差相關(guān),尤其是在TP53突變卵巢癌患者中,UCH-L5 mRNA表達水平的差異更為顯著。而UCH-L5抑制劑bAP15呈劑量依賴性抑制卵巢癌細胞生長并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[19]。

進一步研究表明,UCH-L5誘導(dǎo)卵巢腫瘤發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號通路密切相關(guān)。TGF-β是一類與多種腫瘤相關(guān)的細胞生長調(diào)節(jié)因子,可促進腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移擴散[25]。UCHL5可通過Smad7、Smad2和Smad3調(diào)節(jié)TGF-β通路。通常情況下,Smad7可將泛素化連接酶Smurf1或Smurf2招募到TGF-β受體,誘導(dǎo)其快速經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解,UCH-L5可通過與Smurf2競爭而與Smad7結(jié)合,阻止TGF-β受體的降解,從而導(dǎo)致TGF-β信號上調(diào)。同時,UCH-L5敲低可選擇性降低TGF-β依賴的靶基因P21、PAI-1及MMP-2的活性,而P21、PAI-1和MMP-2對腫瘤的增殖和遷移具有抑制作用[9,26]。此外,UCH-L5同樣也可通過減少Smad2/Smad3的降解而上調(diào)TGF-β信號通路[27]。bAP15處理后,TGF-β誘導(dǎo)的卵巢腫瘤細胞磷酸化Smad2顯著降低。同樣地,敲低UCH-L5也可顯著抑制TFG-β誘導(dǎo)的Smad2磷酸化。采用HA標記泛素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細胞后,使用抑制劑bAP15或shRNA敲除UCH-L5,觀察Smad2的泛素化顯著增加,這進一步明確了UCH-L5抑制劑的Smad2去磷酸化作用依賴于其對胞內(nèi)蛋白的泛素化作用[28]。這些發(fā)現(xiàn)表明,抑制UCH-L5為針對轉(zhuǎn)化生長因子-β激活的卵巢癌的新的靶向治療提供了潛在的機會。

4.3 UCH-L5與子宮內(nèi)膜癌(EC)EC是發(fā)生在子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤,占女性生殖道中惡性腫瘤的20%～30%,據(jù)2019年國家癌癥中心統(tǒng)計,中國子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率為 10.28/10萬,死亡率為1.9/10萬,近年,在世界范圍內(nèi)發(fā)病率成上升趨勢。晚期和復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌的治療仍是亟待解決的臨床問題之一。因此,確定EC發(fā)生和發(fā)展的潛在分子機制對于開發(fā)新的治療策略非常必要。

LIU等[29]對比TCGA數(shù)據(jù)庫中的548個EC組織和35個正常子宮內(nèi)膜組織后發(fā)現(xiàn),與非腫瘤標本相比,EC組織中UCH-L5的mRNA表達水平顯著升高,且UCH-L5 mRNA水平低的患者總體生存期明顯高于UCH-L5 mRNA水平高的患者。隨后,他們檢測了臨床標本中UCH-L5的蛋白量,與生物信息學(xué)結(jié)果一致的是,WB檢測UCH-L5蛋白在內(nèi)膜癌組織中較相鄰正常組織呈顯著過表達狀態(tài)。采用qPCR和WB檢測4種人內(nèi)膜癌細胞株與內(nèi)膜上皮細胞株中UCH-L5的表達,結(jié)果均提示內(nèi)膜癌細胞株的UCH-L5呈不同程度高于內(nèi)膜上皮細胞株。敲低UCH-L5后,內(nèi)膜癌細胞株相對活力下降,細胞凋亡增加,同時細胞周期停滯于G1期。此外,TCGA生物信息富集化結(jié)果顯示CTNNB1 (β-catenin編碼基因)富集與UCHL5基因相關(guān)。過表達UCH-L5,內(nèi)膜癌細胞的β-catenin及其下游CyclinD1、C-myc及抗凋亡蛋白Survivin表達增加;而敲低UCH-L5后,內(nèi)膜癌細胞的β-catenin水平及上述下游分子表達顯著受抑制,凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase 3水平顯著增加,以上提示UCH-L5可能通過β-catenin途徑促進內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染UCH-L5 shRNA慢病毒顆粒的內(nèi)膜癌細胞株皮下注射到雌性裸鼠體內(nèi)。UCHL5沉默明顯抑制裸鼠異種移植瘤的大小、體積和重量。HE染色顯示UCH-L5基因敲除組的腫瘤分化形態(tài)和角化程度均優(yōu)于對照組。與上述體外實驗結(jié)果一致的是,UCH-L5沉默導(dǎo)致β-catenin及其靶基因CyclinD1、C-myc和Survivin的減少,而在體內(nèi)則導(dǎo)致cleaved-caspase3的增加。

NEDD4是屬于HECT家族的泛素連接酶,主要通過在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和蛋白酶體中以泛素化依賴性方式介導(dǎo)蛋白降解來發(fā)揮其生物學(xué)作用。UCH-L5與 NEDD4直接存在相互作用,UCH-L5可通過NEDD4促進PRDX1的泛素化降解,減少其與c-Myc的結(jié)合,致使c-Myc在細胞核內(nèi)聚集,促進癌癥的發(fā)生發(fā)展[30]。同時,NEDD4在子宮內(nèi)膜癌組織中表達顯著增加,其水平隨著炎癥及子宮內(nèi)膜癌的進展而增加[31];而內(nèi)膜癌組織的PRDX1蛋白水平較癌旁組織降低[32],這提示UCH-L5可能是通過NEDD4-PRDX1從而促進子宮內(nèi)膜癌的進展。此外,人子宮內(nèi)膜癌細胞(Ishikawa細胞)過表達NEDD4后,可誘導(dǎo)IGF-1R在細胞表面的表達,并激活PI3K/Akt信號通路,而PI3K通路的激活是侵襲性子宮內(nèi)膜癌的標志之一[33]。由此可見,NEDD4作為泛素連接酶,可能是UCH-L5促進子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。

綜上所述,泛素化-去泛素化系統(tǒng)作為調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的兩個重要方式,調(diào)控著眾多生命活動,包括細胞增殖、生長、分化、凋亡、修復(fù)等。UCH-L5作為泛素羧基末端水解酶家族的主要成員,通過精確調(diào)控蛋白質(zhì)的降解過程,在婦科惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。關(guān)于UCH-L5的研究,目前尚處于起步階段,隨著研究的深入,其對于婦科惡性腫瘤的作用會有更為全面的認識,為婦科腫瘤病因、診斷、治療及預(yù)防提供思路與靶點。