鄭莎莎,崔慶悅,齊艷茹,程 紅,魏 浩,胡揚(yáng)楠,柴人杰,,4,5,6

(1.東南大學(xué)數(shù)字醫(yī)學(xué)工程全國重點實驗室,附屬中大醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,生命健康高等研究院,江蘇省生物醫(yī)藥高新技術(shù)研究重點實驗室,江蘇 南京 210096;2.南通大學(xué)神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南通 226001; 3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,江蘇 南京 210008;4.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,四川 成都 610072;5.中國科學(xué)院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100101;6.首都醫(yī)科大學(xué)北京市神經(jīng)再生修復(fù)研究重點實驗室,北京 100069)

聽力損失影響患者的溝通、認(rèn)知、教育甚至心理健康,對患者的生活質(zhì)量有著重大影響,給社會帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在所有聽力損失中,感音神經(jīng)性耳聾( sensorineural hearing loss, SNHL )是最常見的類型,占絕大多數(shù)[1]。SNHL是很常見的耳疾,全世界約有3.6億人口患有此病[2],其核心原因是耳蝸毛細(xì)胞的損傷和毛細(xì)胞損傷之后的螺旋神經(jīng)元(spiral ganglion neurons, SGNs)的神經(jīng)突退化和細(xì)胞死亡。人工耳蝸(Cochlear implant, CI)是目前治療重度、極重度感音神經(jīng)性耳聾最有效的方法[3],但功能性螺旋神經(jīng)元數(shù)量不足是影響CI植入效果的重大醫(yī)學(xué)難題[3]。因此,保護(hù)或修復(fù)受損的螺旋神經(jīng)元是治療感音神經(jīng)性聽力損失的有效途徑,也是聽覺再生領(lǐng)域的重要研究方向。生物醫(yī)學(xué)工程是近年來逐漸興起的一門交叉學(xué)科,其將工程學(xué)的技術(shù)、原理和設(shè)計概念應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué),其研究目的是提高生活質(zhì)量,減少疾病對個人生活的影響。生物醫(yī)學(xué)工程研究領(lǐng)域廣闊,包括生物材料、組織工程、生物儀器、生物信號等學(xué)科[4]。近年來,生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)在基礎(chǔ)研究方面取得了很大的成績,主要應(yīng)用于骨軟骨[5]、肌肉[6]、皮膚[7]、肝臟[8]等組織的再生中,本文將介紹其在SGNs再生中的應(yīng)用。

1 SGNs

耳蝸中的SGNs可分為I型SGNs和II型SGNs兩個亞組。I 型 SGNs占內(nèi)耳聽覺神經(jīng)元的大多數(shù),是有髓鞘的、大的雙極細(xì)胞,它們將復(fù)雜的聲學(xué)信息通過周圍樹突從內(nèi)毛細(xì)胞傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)[9],而II 型SGNs是無髓鞘的、小的單極細(xì)胞,支配外毛細(xì)胞和為部分支持細(xì)胞提供感覺反饋,控制聽覺上皮層對聲音信號的敏感性[10]。發(fā)育水平上,SGNs屬于終末分化細(xì)胞,不能自發(fā)增殖再生,因此SGNs的變性或者損失對聽力具有嚴(yán)重的破壞性[4],進(jìn)一步導(dǎo)致永久性SNHL[12]。所以SGNs的修復(fù)在治療聽力障礙相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域至關(guān)重要。CI是一種有效的治療手段,但限制CI有效性的因素是電極陣列和SGNs之間存在的解剖間隙,導(dǎo)致電流在非特異性刺激下擴(kuò)散[13]。其中一個解決方法是引導(dǎo)SGNs的神經(jīng)突向刺激電極方向生長[14]。因此,維持和促進(jìn)SGNs的存活和神經(jīng)突生長,并引導(dǎo)其向靶點方向發(fā)展,對于提高的CI表現(xiàn)至關(guān)重要。

2 生物醫(yī)學(xué)工程在SGNs再生中的應(yīng)用

再生損傷的聽覺神經(jīng)的傳統(tǒng)的方法包括:局部提供神經(jīng)營養(yǎng)因子[15]、干細(xì)胞治療[16]、基因治療[17]等,在這些治療方法中,一種前景廣闊的聽覺神經(jīng)修復(fù)方法是運用生物醫(yī)學(xué)工程中的組織工程技術(shù)。研究表明,組織工程技術(shù)可以體外模擬復(fù)雜的組織微環(huán)境,為修復(fù)損傷的組織和器官提供了一種新興方法[18]。其中,使用具有可調(diào)性和獨特性能的仿生支架進(jìn)行引導(dǎo)神經(jīng)突的生長是其方法之一[19]。

2.1 仿生支架調(diào)控仿生支架有著與天然細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)相似的特性,通過其結(jié)構(gòu)和功能來指導(dǎo)新組織的形成[20]。理想的仿生支架應(yīng)當(dāng)具備生物相容性和可降解性,不會引起周圍組織的炎癥反應(yīng)或者毒性反應(yīng)[21],還應(yīng)當(dāng)為細(xì)胞提供機(jī)械和結(jié)構(gòu)支持,減少神經(jīng)軸突分散,以促進(jìn)細(xì)胞附著、生長和增殖[2]。此外,還應(yīng)該具備獨特的性質(zhì),例如能夠引導(dǎo)神經(jīng)突生長排列,適當(dāng)?shù)碾娺B接等[19]。

2.1.1導(dǎo)電生物材料 支架電信號是神經(jīng)元與其他細(xì)胞交流的方式,這在神經(jīng)發(fā)育和成熟過程中具有重要意義?；|(zhì)的導(dǎo)電性有利于細(xì)胞間電信號的傳遞,或有效地向細(xì)胞傳遞外部電信號[22]。因此,導(dǎo)電生物材料在神經(jīng)組織工程中得到了廣泛的應(yīng)用。Hu等通過將超順排碳納米管(super-aligned carbon-nanotube sheets, SACNTs)組裝到的甲基丙烯酸酯化明膠(methacrylated gelatin, GelMA )水凝膠上來構(gòu)建支架,他們制備的復(fù)合材料繼承了GelMA水凝膠的良好生物相容性和碳納米管的高導(dǎo)電性。研究結(jié)果表明,GelMA - SACNT促進(jìn)了SGNs的定向排列和神經(jīng)突的生長,同時促進(jìn)了依賴鈣離子的神經(jīng)元信號的傳遞[23]。在另一項研究中,他們將SACNTs集成到大藍(lán)閃蝶鱗翅上,并通過GelMA水凝膠促進(jìn)SACNTs與鱗翅的結(jié)合,提高支架的生物相容性。其三維的有序拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能夠誘導(dǎo)SGNs的取向排列,并促進(jìn)SGNs神經(jīng)突的定向生長[24]。

2.1.2磁性誘導(dǎo) 此外,神經(jīng)再生除了需要新生神經(jīng)元的功能成熟外,還需要新生神經(jīng)元突起的定向生長。磁性納米顆粒在外部如熱、光和磁場等刺激下,可以產(chǎn)生物理化學(xué)變化,已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[25]。它們具有高穩(wěn)定性、無細(xì)胞毒性和生物相容性的優(yōu)點,在磁場下具有高磁化強(qiáng)度[26]?；诖?Xia等通過磁性膠體納米顆粒(Fe3O4內(nèi)核和SiO2外殼)在磁場作用下的自組裝,制備了具有各向異性的磁性膠體納米鏈,并從接種的SGNs 中發(fā)現(xiàn)新生神經(jīng)突起沿著納米鏈的良好取向,誘導(dǎo)了種子SGNs的排列,種子SGNs的生長錐發(fā)育和突觸形成得到了促進(jìn),這對再生過程中神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重排和神經(jīng)信號通訊的恢復(fù)具有重要意義。值得一提的是,通過調(diào)節(jié)磁場,可以構(gòu)建多向可逆的納米鏈,從而實現(xiàn)SGNs向多個方向定向排列[27]。最近的研究已經(jīng)證明了另外一種磁性納米顆粒:超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide, SPIO)納米顆粒指導(dǎo)軸突取向的能力[28],Hu等的工作進(jìn)一步證明了SPIO納米顆粒對SGNs具有良好的生物相容性,并且由SPIO納米顆粒在磁場內(nèi)產(chǎn)生的機(jī)械張力可以促進(jìn)神經(jīng)元生長并引導(dǎo)SGNs神經(jīng)突的方向,這使得操縱和定向軸突以實現(xiàn)所需的方向生長成為可能[29]。

2.1.3水凝膠支架 在生物材料中,水凝膠具有優(yōu)異的物理和化學(xué)性質(zhì),例如高度吸濕性、可調(diào)節(jié)的機(jī)械性能、以及易修飾的三維交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[30]。在之前的研究中,原代SGNs的細(xì)胞培養(yǎng)方案一般為二維培養(yǎng),但Yan等的研究證明三維培養(yǎng)系統(tǒng)相比較二維更有利于保存SGNs的精致結(jié)構(gòu)和功能。他們利用轉(zhuǎn)基因小鼠純化SGNs群體,建立了3D基質(zhì)培養(yǎng)系統(tǒng),并證明3D基質(zhì)培養(yǎng)環(huán)境顯著提高SGN體外存活率,并且克服了2D系統(tǒng)的培養(yǎng)時長上限,促進(jìn)了整個培養(yǎng)期間SGNs的存活,并維持了其形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能。因此三維基質(zhì)培養(yǎng)環(huán)境可以作為長期培養(yǎng)純化的SGNs生理和病理研究的有用工具[12]。這些性質(zhì)對于細(xì)胞的生長和成熟非常有益,也使水凝膠成為最有潛力的支架材料之一。自組裝多肽基水凝膠由于其形成的三維納米結(jié)構(gòu)模仿ECM環(huán)境,并且生物活性可以被特異性地控制而受到特別關(guān)注[31]。肽基水凝膠的主要優(yōu)點包括其生物相容性、作為溶液的可注射性以及易于分子修飾。為了模擬自然的細(xì)胞環(huán)境,ECM衍生物——層粘蛋白中的生物活性表位IKVAV (Ile-Lys-Val-Ala-Val)可以共價偶聯(lián)到水凝膠形成肽上,在IKVAV -肽基水凝膠中觀察到它促進(jìn)了培養(yǎng)的神經(jīng)元的神經(jīng)突生長[32]。這個結(jié)果強(qiáng)調(diào)了生物功能化多肽水凝膠在神經(jīng)再生中的潛力。

2.2 電刺激調(diào)控由于CI的整體效果較好,越來越多的殘聽患者接受了CI植入,術(shù)后患者通常會保留低頻的殘余聽力。CI是電刺激的產(chǎn)生者,然而,關(guān)于電刺激對神經(jīng)行為的影響仍存在爭議。Shen等結(jié)果表明,當(dāng)電刺激強(qiáng)度大于50 μA或者刺激時間超過8小時后,電荷平衡雙向電刺激可顯著降低SGNs神經(jīng)突的長度[33]。然而,有研究表明電刺激可以直接激活SGNs及其周圍突起[34];此外,還有動物研究表明,與未治療的對照組相比,經(jīng)電刺激治療的動物的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突明顯更長[35];Scheper等的研究結(jié)果則發(fā)現(xiàn)電刺激可以提高SGNs的存活率[36]。研究結(jié)果的差異可能是由于電刺激對各種細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)取決于細(xì)胞類型、狀態(tài)和電刺激的參數(shù)[37]。

為了深入研究電刺激對SGNs生長的調(diào)控模式,多位研究者開發(fā)了體外電刺激研究體系。Peter等所開發(fā)的刺激室和裝置用于體外電刺激參數(shù)篩選,該裝置具有一個可以改變電流幅度和脈沖寬度等參數(shù)的徑向電場的刺激室,以實現(xiàn)對SGNs的體外電刺激。研究結(jié)果提供了參數(shù)集/電荷密度,可用于體外研究電刺激對SGNs損傷的影響,并篩選保護(hù)策略,以維持和保護(hù)植入物患者的殘余聽力[38]。我們團(tuán)隊開發(fā)了一種高效的CI電聲刺激(electroacoustic stimulation, EAS)系統(tǒng),并將不同的導(dǎo)電材料引入到該電刺激培養(yǎng)體系中,探究了該系統(tǒng)對SGNs生長發(fā)育的調(diào)控作用。我們發(fā)現(xiàn)CI/石墨烯EAS系統(tǒng)的長期刺激可促進(jìn)SGNs生長錐的發(fā)育,從而促進(jìn)其神經(jīng)突的生長[39]。同時還發(fā)現(xiàn)該體系能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化,并促進(jìn)新生神經(jīng)元的生長,為人工耳蝸植入與干細(xì)胞移植相結(jié)合的治療體系提供了理論基礎(chǔ)[40]。為了更好地模擬體內(nèi)微環(huán)境,我們將導(dǎo)電材料MXene引入三維Matrigel基質(zhì)膠中,進(jìn)一步與系統(tǒng)整合構(gòu)建了三維的基于人工耳蝸的電刺激系統(tǒng),并發(fā)現(xiàn)在該系統(tǒng)中低頻電刺激能夠促進(jìn)SGNs神經(jīng)突的生長及突觸發(fā)育,并且能夠促進(jìn)由Ca2+介導(dǎo)的細(xì)胞間的信號傳遞[41]。相關(guān)的研究結(jié)果可能為臨床上人工耳蝸的使用提供深刻的見解,從而對SNHL患者有所幫助。此外還有諸多在動物模型上的研究表明耳蝸內(nèi)慢性電刺激可減少SGNs變性[36,42,43],然而這些研究主要集中在豚鼠、大鼠和貓等小動物上,在今后的研究中,還需進(jìn)一步在猴、豬等大動物模型中驗證這些電刺激模式對內(nèi)耳SGNs的影響。

2.3 聯(lián)合調(diào)控策略SGNs的發(fā)育和維持結(jié)合多種治療策略,可能會取得更好的效果[44]。耳聾動物耳內(nèi)外源性或轉(zhuǎn)基因神經(jīng)營養(yǎng)因子如神經(jīng)營養(yǎng)因子-3和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)可促進(jìn)SGNs神經(jīng)突的再生,這些新生的神經(jīng)突可能會減少CI植入電極與其靶向SGNs之間的間隙,從而提高電刺激的空間分辨率[33]。有很多研究者探究了營養(yǎng)因子和電刺激聯(lián)合調(diào)控對SGNs的影響。Shepherd等發(fā)現(xiàn)當(dāng)BDNF和電刺激的聯(lián)合給藥時,對SGNs的保護(hù)效果更好[45]。CI植入是電刺激的產(chǎn)生者,Wey等也證明了SGNs在CI植入物上的生長將通過BDNF等刺激蛋白的分泌而增強(qiáng)[46]。此外,神經(jīng)營養(yǎng)因子和支架的聯(lián)合作用也被討論。研究表明,用硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)和BDNF同時治療SGN外植體可促進(jìn)神經(jīng)突生長增強(qiáng)[47]。Wille等在攜帶HS涂層的可生物降解聚合物纖維中加載了BDNF,結(jié)果發(fā)現(xiàn)從纖維中遞送的BDNF大大提高了SGNs在體外的存活率,它們?yōu)檫M(jìn)一步發(fā)展未來的神經(jīng)元引導(dǎo)支架提供了有前途的基礎(chǔ)材料[14]。

根據(jù)近年來SGNs再生的基礎(chǔ)研究,可以通過干細(xì)胞的自我更新、低免疫原性、遷移能力和分化成不同類型細(xì)胞的潛力來替代SGNs不可再生的損失[40]。因此,將各種調(diào)控因素與干細(xì)胞移植有機(jī)結(jié)合可能對SGNs的再生有重大意義。Zhang等提出干細(xì)胞療法與人工耳蝸相結(jié)合可以提高人工耳蝸的性能[44]。Guo等研究表明,基于CI的EAS系統(tǒng)能夠顯著促進(jìn)NSCs的向神經(jīng)元的分化并促進(jìn)新生神經(jīng)元的成熟,暗示將人工耳蝸植入與神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)移植相結(jié)合可能是進(jìn)一步提高人工耳蝸植入效果的有效治療策略[40]。另外,將神經(jīng)營養(yǎng)因子與干細(xì)胞聯(lián)合使用,能夠成功再生嚙齒動物的SGNs,這推進(jìn)了CI植入技術(shù)的巨大發(fā)展[48]。綜上所述,整合多種策略的聯(lián)合調(diào)控方案可能是再生SGNs的有效手段。

3 展望

CI的出現(xiàn)已經(jīng)改變了成千上萬的聽力損失患者的生活,但要想讓那些接近自然聽力的人獲得更好的結(jié)果,還需要對治療方法進(jìn)行改善。利用生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)制備出更適合SGNs的仿生支架是一種有前景的方法,例如活體電極等;此外使用有利于SGNs生長的材料也是未來的研究方向之一,例如導(dǎo)電水凝膠,還可以開發(fā)新的基于肽的水凝膠,使其在生理條件下自組裝,這些水凝膠有望在SGNs和CI之間創(chuàng)建無間隙界面。此外,光學(xué)刺激被認(rèn)為是傳統(tǒng)電刺激的替代方案,因為它可以克服CI電流傳播的固有限制——電流擴(kuò)散引起的分辨率問題,并且可以精確地調(diào)整到模擬復(fù)雜聲音所需的頻率和強(qiáng)度分辨率[49]。理想情況下,這種方法將在生物醫(yī)學(xué)設(shè)計中創(chuàng)造巨大的應(yīng)用價值。