古興亮,林昭錦,齊潔玉,柴人杰,3,4,5,6

(1.東南大學數(shù)字醫(yī)學全國重點實驗室,附屬中大醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,生命科學與技術學院,生命健康高等研究院,江蘇省生物醫(yī)藥高新技術研究重點實驗室,江蘇 南京 210096;2.華南理工大學生物科學與工程學院,廣東 廣州 510000;3.南通大學神經再生協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南通 226001;4.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,四川 成都 610072;5.中國科學院干細胞與再生醫(yī)學研究中心,北京 100101;6.首都醫(yī)科大學北京市神經再生修復研究重點實驗室,北京 100069)

聽力損傷作為危害人類健康前三名的疾病,在全世界范圍內有近五分之一的人被其困擾。 由于成年哺乳動物毛細胞損傷或丟失后的不可再生性,研究和揭露聽力損傷相關的機制并制定干預策略對全人類有著非比尋常的意義。內耳是感知聲音和平衡的器官。全世界超過6%的人患有聽力損失,同樣有6%的人患有平衡障礙。雖然內耳疾病常見,但干預和恢復其感覺和平衡功能的方法有限。聽力損失致病機制研究和開發(fā)治療干預措施需要明確控制組織發(fā)育、存活的信號通路的基礎知識,并建立基于人類細胞的治療策略。內耳的體外模型,如類器官系統(tǒng),可以幫助識別新的保護或再生藥物,以及開發(fā)新的基因療法。

1 內耳

2019年全球有15.7億人被聽力損傷所困擾,約占總人口五分之一,在“全球疾病負擔”分析中,危害健康的傷殘損傷的病因前三名為腰痛、偏頭痛和聽力障礙。大多數(shù)永久性聽力缺失都是感音神經型的[1]。人耳可以大致分為外耳、中耳和內耳三部分[2],其中內耳包含聽覺感受器和方位感受器,內耳的機械感受器主要由感覺毛細胞和支持細胞組成[3]。感覺毛細胞能夠將機械刺激轉化為電化學信號,隨后激活螺旋神經元(spiral ganglion neuron,SGNs)。前庭組織中的其他感覺斑塊,包括橢圓囊、球囊和半規(guī)管的壺腹嵴,都含有感覺毛細胞,負責感知線性運動、重力和頭部旋轉,共同維持平衡感。耳蝸感覺上皮中存在兩種類型的毛細胞,內毛細胞和外毛細胞,作為主要聲音受體其作用是放大上皮中的聲音誘導振動[4, 5]。在鳥類中,內耳毛細胞可以持續(xù)的更新[6～10],毛細胞的損傷可以激活病變區(qū)域支持細胞和毛細胞有絲分裂和分化[11, 12],從而恢復內耳功能[13, 14]。普遍認為哺乳動物毛細胞僅在胚胎發(fā)育過程中產生,成年哺乳動物內耳毛細胞損傷或丟失后將很難再生[3, 15～22]。

2 內耳類器官的構建與發(fā)展

類器官是指由胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)、誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)、組織前體細胞或者成體細胞,在體外自組裝形成的能部分模擬體內組織結構與功能的細胞聚合體[23, 24]。2009年Sato等首次成功地在體外培養(yǎng)出了真正意義上的腸道類器官[25],這種腸類器官體系的成功建立開啟了類器官研究的新篇章。近幾十年,隨著體外干細胞培養(yǎng)技術的進步以及人們對細胞外基質的深入理解,不同組織器官的類器官培養(yǎng)系統(tǒng)逐步受到重視并被建立和優(yōu)化。目前,已經建立了包括腦、腎臟、肺、腸等在內的多種類器官培養(yǎng)技術[26]。類器官技術的快速發(fā)展在疾病發(fā)生發(fā)展機制的研究[27]、建立新的藥物篩選方案[23]以及治療策略[28]等諸多方面都發(fā)揮了極其重要的作用。

目前的內耳類器官衍生方案大多為在早期誘導期間操縱轉化生長因子β (transforming growth factor,TGFβ),骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein, BMP) 和成纖維細胞生長因子 (fibroblast growth factor, FGF),在分化后期激活Wnt信號通路來促進耳基板形成[29～31]。2010年Oshima等首次證明了功能性內耳毛細胞可以衍生自ESC和iPSCs[32]。2014年Karl等首次描述了一種利用三維 (3D) 小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)物生成內耳類器官的培養(yǎng)系統(tǒng),提供了一種體外可重復、可擴展生成內耳感覺組織的方法。其中內耳感覺組織在一定的生化條件下由小鼠胚胎干細胞產生,該模型適用于內耳生物學和再生的基礎和轉化研究[29]。2016年Mills等描述了一種用于產生內耳感覺上皮的3D培養(yǎng)方法,生成感覺毛細胞的同時還生成了神經元群[33]。之后Koehler等給出了一種將人類多能干細胞分化為含有功能性毛細胞的內耳類器官的方法。Koehler等使用3D培養(yǎng)系統(tǒng),通過調節(jié)TGF、BMP、FGF和Wnt信號,誘導單個干細胞聚集體產生多耳囊泡結構。同時使用CRISPR / Cas9,生成了ATOH1-P2A-eGFP細胞系來檢測誘導衍生毛細胞的效果,并證明衍生的毛細胞具有類似于天然感覺毛細胞的電生理特性。該培養(yǎng)系統(tǒng)將有助于闡明人類內耳發(fā)育的機制和測試潛在的內耳疾病相關療法[30]。Nie等發(fā)表了一種體外3D分化方法,將人多能干細胞(human pluripotent stem cell, hPSCs)聚集在低結合的96孔板中,并用細胞外基質蛋白處理從而促進其上皮化。用逐步調節(jié)BMP、FGF和Wnt等信號通路的小分子以及使用重組蛋白處理類器官,有順序地誘導非神經外胚層、耳-鰓外胚層區(qū)和耳基板的形成。耳基板隨后經歷自我引導的形態(tài)發(fā)生并形成耳囊泡,最終產生含有內耳毛細胞和支持細胞的感覺上皮組織,以及與毛細胞有突觸連接的神經元。這些hPSCs來源的內耳感覺結構被認定為人類內耳類器官[34]。Kurihara等提出了一種高效的將人iPSCs分化為含有SGNs樣細胞的內耳類器官的方案,并在內耳類器官的表面鑒定出與SGNs基因表達模式相似的神經元細胞。這些細胞表現(xiàn)出神經元特異性的電壓和時間依賴性的電流特性,類似于在嚙齒動物SGNs中看到的兩種不同放電模式[35]。Liu等在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導小鼠胚胎干細胞產生機械敏感毛細胞,發(fā)現(xiàn)類器官毛細胞的機械敏感性相當于正常小鼠功能成熟的毛細胞,并擁有類似的離子通道表達動態(tài)發(fā)育過程,和天然前庭毛細胞相似[36]。Osaki 等開發(fā)以一種誘導前庭毛細胞分化的類器官培養(yǎng)體系,使用前庭細胞來源的限定培養(yǎng)基會增強前庭毛細胞相關標志物(Math1, Myosin6, Brn3c, Dnah5)的表達,但未增強耳蝸毛細胞相關標志物Lmod3的表達[37]。

3 內耳類器官的應用

3.1 模擬發(fā)育內耳類器官可用于研究早期耳板誘導,評估毛細胞和內耳感覺神經元發(fā)育,以及毛細胞與感覺神經元之間的突觸發(fā)生。進一步揭示了人類內耳毛細胞再生的機制,使類器官成為研究內耳遺傳疾病和干細胞療法的重要工具[30]。內耳類器官的3D培養(yǎng)系統(tǒng)可以產生大量功能齊全的感覺細胞,可用于研究內耳發(fā)育和疾病的機制以及內耳修復的再生機制[36]。內耳類器官模型也是首次提供驗證基于藥物的療法、基因靶向方法和細胞替代療法的內耳工具[38]。Nie 等使用人類多能干細胞衍生的類器官作為模型系統(tǒng)研究CHD7突變如何影響內耳發(fā)育,CHD7在調節(jié)人類耳系規(guī)格和毛細胞分化中起著關鍵作用。該研究結果揭示了與CHARGE綜合征相關的內耳表型的分子基礎,提供了潛在的治療靶基因和途徑[39]。

目前對人類耳聾的細胞和分子生物學以及更廣泛的人類聽覺系統(tǒng)的大部分理解都是從動物模型的觀察和實驗研究中推斷出來的。由于無法在不對聽力或平衡器官造成重大、不可逆轉損害的情況下進行人體活檢,因此通常對人類內耳細胞的生物學研究僅限于稀少的胎兒或尸體組織。利用內耳類器官模擬遺傳性耳聾,對開發(fā)新的治療方法,如生長因子、干細胞和基因療法有著非比尋常的意義,同時也是非常好的臨床前測試高保真模型[1]。

3.2 致聾機制研究此外,在類器官模型中應用基因靶向技術,可以敲除和敲入基因以研究不同基因對內耳毛細胞分化與發(fā)育的作用[40, 41]。Cong等設計了兩種不同的II型CRISPR / Cas9系統(tǒng),具有簡單可編程性和廣泛適用性,利用短RNA指導Cas9核酸酶精確切割人類和小鼠細胞中內源性基因組位點,將多個引導序列編碼到單個CRISPR陣列中,可以實現(xiàn)哺乳動物基因組多位點同時編輯[42]。利用類器官和基因編輯技術可以很好的構建不同的基因缺陷型耳聾模型,一般是從遺傳性耳聾患者身上收獲體細胞,通常是真皮成纖維細胞或外周血單核細胞,并將其轉化為iPSC,可以形成具有不同遺傳缺陷的細胞系[43]。

3.3 耳聾治療研究此外還可以建立一個強大的高通量耳蝸類器官平臺,促進人工耳蝸祖細胞的3D擴增和毛細胞的時間調節(jié)分化。Liu 等對FDA批準的藥物庫進行高通量篩選,將VEGFR抑制劑瑞戈非尼確定為用于毛細胞分化的強效小分子,該研究不僅證明了耳蝸類器官平臺在毛細胞生理學高通量分析中的能力,而且還強調了VEGFR-MEK-TGFB1信號串擾作為毛細胞再生和聽力恢復的潛在靶標[44]。Kurihara 等證明內耳類器官具有用作藥物誘導神經病變實驗模型的潛力,以及為將來開發(fā)聽力缺失的新治療方法提供幫助[30]。內耳類器官為內耳發(fā)育和病理發(fā)生觀察提供了優(yōu)秀體外模型,在尋找新療法的過程中,加速治療藥物的發(fā)現(xiàn)。內耳類器官還可用于測試病毒介導的先天性聽力損失障礙基因療法[44, 45],并篩選耳毒性藥物暴露后再生感覺毛細胞的小分子化合物[46]。

4 總結與展望

內耳作為重要的感覺器官之一, 對其的研究從未停止過。內耳類器官在內耳研究鄰域發(fā)揮了重要的作用,也極大地推進了內耳器官的研究進展。同樣,對內耳類器官誘導構建的研究從未停止過。異質性是部分3D培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)勢同時也是局限性。與單層培養(yǎng)模式不同,類器官中的細胞根據(jù)其在類器官中的空間位置接收不同濃度的信號線索,常導致位于類器官不同深度的細胞不同步分化,表層中的細胞分化得更快。此外,內耳內器官僅產生前庭感覺器官樣結構。未來仍需要對協(xié)同調控策略進行進一步修改,開發(fā)耳蝸細胞類型的誘導和分化新方法,包括如何衍生出耳蝸型毛細胞樣細胞,新生毛細胞是否存在細胞與細胞間連接,以及內耳類器官是否容易受到導致人類和其他哺乳動物耳聾的相同外在損傷,以及如何在體外再現(xiàn)調控內耳的血液供應的脈管系統(tǒng)。