林慧，李悅，趙家樂，林植華，樊曉麗

（麗水學院生態(tài)學院，浙江 麗水 323000）

在水生動物的生長、發(fā)育和繁殖過程中，呼吸代謝是其代謝活動的重要組成部分。耗氧率的高低不僅直接反映了水生動物的代謝強度和生理狀況，而且直接影響水體溶氧量[1-2]。動物個體耗氧率主要取決于溫度、鹽度、攝食能力、發(fā)育階段和生態(tài)因子等因素[3]。近年來，國內(nèi)外學者圍繞枝角類、魚類、貝類等水生動物耗氧率的測定及其影響因素展開了較多研究[1-2，4-6]，而關(guān)于無尾兩棲類幼體蝌蚪耗氧率方面的研究報道較少[7-9]。

黑斑側(cè)褶蛙（Pelophylax nigromaculatus）隸屬于無尾目（Anura），蛙科（Ranidae），側(cè)褶蛙屬（Pelophylax），廣泛分布于我國東部各省，是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟動物[10-11]。國內(nèi)關(guān)于黑斑側(cè)褶蛙的研究主要涉及疾病防治、養(yǎng)殖技術(shù)、生長發(fā)育和毒理學等方面[12-15]，未見其耗氧率方面的研究報道?，F(xiàn)開展溫度對不同發(fā)育階段黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率的影響試驗，以了解無尾兩棲類蝌蚪在不同發(fā)育時期的代謝特征，也為該物種的適宜養(yǎng)殖條件提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗用黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪來自浙江省麗水學院兩棲爬行動物實驗室。選用同一天產(chǎn)下的黑斑側(cè)褶蛙卵團孵化發(fā)育成的蝌蚪，飼養(yǎng)在室外養(yǎng)殖池中，每天定量投喂專用蝌蚪粉質(zhì)飼料。在體視解剖鏡下，依據(jù)后肢發(fā)育程度，將蝌蚪分為3 個不同發(fā)育階段：發(fā)育早期（ESD，26～27 期）、發(fā)育中期（MSD，28～32 期）和發(fā)育晚期（LSD，38～40 期）[16]。每次試驗前，蝌蚪經(jīng)充分曝氣自來水暫養(yǎng)2 d，試驗前12 h禁食，避免攝食代謝對耗氧率產(chǎn)生影響。所有蝌蚪不重復使用，減少試驗誤差。

1.2 靜水法測定溶解氧

試驗設計考慮溫度和蝌蚪發(fā)育階段這2 種因素。測試溫度為 20，24，28 和 32 ℃，蝌蚪發(fā)育階段分為早、中和晚，共12 個試驗組合，每個組合設置4 個重復組。由于處于不同發(fā)育階段的單只黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪體質(zhì)量不同，通過控制蝌蚪數(shù)量，使得不同溫度組的蝌蚪總濕質(zhì)量處于基本相同水平。根據(jù)預試驗，60 只發(fā)育早期、10 只發(fā)育中期和4 只發(fā)育晚期的黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪的總濕質(zhì)量為3.0～3.5 g。

試驗開始時，XMTD-7000 型恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)的水溫設定后為 20，24，28 或 32 ℃，同時放入 4 個裝滿24 h 曝氣后水的1 L 寬口瓶（作為呼吸室）中。待水溫達到設定值后，用DO200A 溶氧儀測定每個呼吸室的初始溶解氧（DO）質(zhì)量濃度，記作DO0。根據(jù)不同發(fā)育階段，將一定數(shù)量的黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪輕輕快速地放入呼吸室中，立即用保鮮膜和橡皮筋進行封口，保證外界空氣無法進入瓶內(nèi)。在試驗進行至3 和6 h 時，依次取下保鮮膜，測定呼吸室內(nèi)的DO質(zhì)量濃度，分別記作DO3h和DO6h。每次測定后重新快速封口。試驗過程注意觀察蝌蚪的狀態(tài)。

1.3 蝌蚪濕質(zhì)量和體積測定

測定DO 后，撈出蝌蚪，用紗布輕輕吸取其體表水分。利用量筒差量法測定每組蝌蚪的總體積：先在量筒中倒入一定量的水，記作V1；再將每組蝌蚪倒入量筒，水面上升，記作V2；根據(jù)兩者差值（V2-V1）即可求出每個試驗組蝌蚪的總體積V（±0.01 mL）。用Mettler 分析天平稱取每個試驗組蝌蚪的總濕質(zhì)量 M（±0.001 g）。

1.4 耗氧率的計算

根據(jù)試驗前后呼吸室內(nèi)的水中DO 變化，計算出不同試驗組黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪在3 和6 h 的耗氧率，具體公式如下[17]：

式中：OCR——耗氧率，mg/（g·h）；DO0——初始溶解氧，mg/L；DOx——3 和6 h 時的溶解氧，mg/L；V——呼吸室的有效體積，即呼吸室體積減去蝌蚪體積，mL；M——蝌蚪總質(zhì)量，g；t——試驗時間，h。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Statistica 統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。在進行方差分析之前，檢驗數(shù)據(jù)的方差同質(zhì)性和正態(tài)性。用雙因素方差分析和Tukey’s 檢驗進行組間比較。對不同溫度組的耗氧率進行曲線擬合。描述性統(tǒng)計用“平均值±標準誤差”表示，顯著性水平α設為0.05。

2 結(jié)果與分析

不同試驗組黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪形態(tài)特征及呼吸室內(nèi)的DO 質(zhì)量濃度測量值見表1。

表1 不同試驗組黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪形態(tài)特征和DO 質(zhì)量濃度測定的描述性統(tǒng)計

溫度對不同發(fā)育階段黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪3 和6 h耗氧率的影響見表 2、圖 1（a）（b）（c）（d）（e）（f）和圖 2（a）（b）（c）（d）（e）（f）。

圖2 溫度對不同發(fā)育階段黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪6 h 耗氧率的影響

由表2 可見，溫度和發(fā)育階段之間的交互作用也對黑斑側(cè)褶蛙3 和6 h 耗氧率產(chǎn)生顯著影響。

由表2、圖1 和2 可見，溫度對黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪 3 和 6 h 耗氧率的影響顯著（P＜0.05）；32 和 28 ℃耗氧率顯著＞24 ℃，24 ℃耗氧率顯著＞20 ℃。發(fā)育階段對黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪3 和6 h 耗氧率的影響也顯著（P＜0.05），發(fā)育晚期的黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率顯著大于早期和中期。當溫度為20～32 ℃時，發(fā)育早、晚期黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪的3 和6 h 耗氧率，均與溫度之間呈三次函數(shù)擬合回歸關(guān)系，中期呈二次函數(shù)擬合回歸關(guān)系。

表2 溫度和發(fā)育階段對黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率影響的雙因素方差分析結(jié)果①

圖1 溫度對不同發(fā)育階段黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪3 h 耗氧率的影響

3 討論

3.1 溫度對黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率的影響

水生動物的耗氧率通常受內(nèi)在因素和外部生態(tài)因子的影響，其中溫度是影響水生動物呼吸代謝最重要的生態(tài)因子之一[2，5，18]。研究表明，硬殼蛤的耗氧率隨著試驗溫度的升高而升高[19]。付監(jiān)貴等[4]研究發(fā)現(xiàn)，梭鱸幼魚的耗氧率也會隨著溫度的升高而呈上升趨勢。但試驗溫度為10～25 ℃時，淡水蝦夷扇貝和花緣牡蠣的耗氧率呈先上升后下降的趨勢[5，20]。羅輝玉等[21]研究發(fā)現(xiàn)，灰海馬的耗氧率和測試溫度之間也呈相同變化趨勢。在最適溫度以下，浮游動物西藏擬溞和中華哲水蚤的耗氧率隨溫度升高而增大，超過最適溫度，其耗氧率卻呈下降趨勢[22-23]。

本研究表明，不同發(fā)育階段黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率與溫度之間的變化趨勢與上述2 種研究結(jié)果類似：發(fā)育早、晚期黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪的耗氧率，均隨溫度的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但發(fā)育中期黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪的耗氧率，則隨溫度的上升呈持續(xù)上升的趨勢。這可能是由于黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪屬于變溫動物，其體溫接近于飼養(yǎng)水溫，水溫上升加快了新陳代謝，從而提高耗氧率；而溫度過高時，蝌蚪體內(nèi)酶活性可能受到抑制，導致物質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，最終引起耗氧率的下降。另有研究[24]發(fā)現(xiàn)，當水溫高達31 ℃時，墨西哥灣扇貝耗氧率明顯下降，這是由于升溫提高了其蛋白質(zhì)代謝，相應降低了碳水化合物及脂肪的代謝，這也可能是32 ℃時發(fā)育早、晚期黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率下降的原因。發(fā)育中期的黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪，其生長發(fā)育較快，新陳代謝相應加快，耗氧量也隨之增加，由此推測其對溫度的適應范圍更廣，超出了本試驗設計的最高溫度，其原因有待于進一步探究。

3.2 發(fā)育階段對黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率的影響

當溫度為20～32 ℃時，發(fā)育晚期黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪的耗氧率顯著大于早、中期，可能與蝌蚪鰓的發(fā)育程度有關(guān)。與魚類等其他水生動物相似，鰓是蝌蚪攝取水中溶解氧的重要器官[25]。文獻[2]研究表明，發(fā)育晚期，蝌蚪的呼吸鰓比發(fā)育早、中期更發(fā)達，攝取水中溶解氧的能力更強，故蝌蚪的載氧率提高。關(guān)于卵形鯧鰹的研究[26]發(fā)現(xiàn)，隨著仔稚魚個體的不斷長大，鰓小片的表面積變大，鰓的呼吸面積隨之增大，從而提高水流與血液之間的氣體交換，耗氧量不斷增加，故耗氧量隨體質(zhì)量增加而增大。

從發(fā)育角度來看，生活在水中的蝌蚪是無尾類的幼體階段，其耗氧率直接反映了無尾兩棲類水生動物幼體階段的新陳代謝狀況與能量需求。蝌蚪的生長發(fā)育過程伴隨著腦、鰓、肝臟等高耗氧器官的逐步完善，從而導致能量需求大大增加，新陳代謝更加旺盛，結(jié)果表現(xiàn)為發(fā)育晚期蝌蚪的耗氧率大幅度上升[27]。這表明了蝌蚪在生長發(fā)育過程中，其代謝特征與發(fā)育過程中的結(jié)構(gòu)特點以及生理變化緊密相連。因此，根據(jù)黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪不同發(fā)育階段的耗氧率特點，在蝌蚪飼養(yǎng)后期，一定要提高養(yǎng)殖水體中的溶氧量，否則易造成蝌蚪窒息死亡。耗氧率高低也是代謝水平高低的重要標志，在養(yǎng)殖過程中要保證充足的餌料供給，以滿足蝌蚪正常生長發(fā)育的需要。

在一定溫度范圍內(nèi)，耗氧率隨水生動物個體發(fā)育進程的推進呈逐漸上升趨勢，這一現(xiàn)象也出現(xiàn)在其他水生動物養(yǎng)殖過程中。例如，枝角類的發(fā)頭裸腹溞和隆線溞在第一幼齡發(fā)育至第一成齡階段時，個體耗氧率相對較小，而由第一成齡發(fā)育至第二成齡階段時，其生長發(fā)育速度較快，新陳代謝速度相應加快，個體耗氧率顯著增大[1]。河川沙塘鱧在早期發(fā)育過程中耗氧率逐漸上升[28]。已有研究[29]發(fā)現(xiàn)，澳大利亞麥龍蝦的耗氧量與體質(zhì)量成正比。

3.3 試驗時間對黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率的影響

目前對水生動物耗氧率變化測定的試驗時間不統(tǒng)一，有研究對三角帆蚌[30]、蝦夷扇貝[15]、橄欖蚶[31]、墨西哥灣扇貝測定了 1.5，2，4 和 6 h 耗氧量。本研究顯示，不同溫度和發(fā)育階段下，黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪3 和6 h 耗氧率變化基本保持一致，確定3 h作為后續(xù)研究蝌蚪耗氧率的測定時間。

綜上所述，當飼養(yǎng)水溫為20～28 ℃時，黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪的耗氧率隨溫度的升高而提高，但當水溫達到32 ℃時，發(fā)育早、晚期蝌蚪的耗氧率開始下降，而中期蝌蚪的耗氧率繼續(xù)上升。在黑斑蛙養(yǎng)殖過程中，要根據(jù)蝌蚪的發(fā)育階段提供適合的水溫和充足的溶解氧，避免蝌蚪的窒息死亡。