任仲麗 劉 珍 沙玉林 曹魯娜 鄭兆顯*

喘舒片收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑第三冊》[1]，溫腎納氣、化痰定喘，臨床上多用于治療慢性支氣管炎、支氣管哮喘、肺氣腫，尤其適用于喘息性氣管炎，由升華硫、大黃粉、鹽酸克侖特羅、黃芩提取物混勻制成?，F(xiàn)代大量研究發(fā)現(xiàn)大黃及黃芩對細(xì)菌、霉菌和酵母菌都有一定的抑制作用[2-13]，因此對喘舒片進(jìn)行微生物限度檢查時必須首先消除樣品本身的抑菌活性，才能保證檢查方法的科學(xué)、有效，確保廣大人民的用藥安全。

本研究選取3 家藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的8 批喘舒片進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性試驗，建立喘舒片微生物限度檢查方法，為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試品來自3 家不同藥企生產(chǎn)的8 批不同批次的喘舒片。

1.1.2 菌種均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，經(jīng)本實驗室鑒定合格，所用菌懸液均為第4 代。

1.1.3 培養(yǎng)基與稀釋液均購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.4 儀器電子天平、高壓蒸汽滅菌器、生物安全柜、細(xì)菌濁度儀、精密恒溫培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備按《中華人民共和國藥典》四部通則1105、1106 菌液制備的要求[14]進(jìn)行制備。

1.2.2 供試液制備按《中華人民共和國藥典》四部通則1105、1106 供試液制備要求[14]依次制備1∶10、1∶20、1∶50、1∶100、1∶200、1∶500 的供試液。

1.2.3 需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗

1.2.3 .1 常規(guī)法用“1.2.2”項下1∶10 或1∶100的供試液，分別制備試驗組、供試品對照組、菌液對照組，每組取1 ml 注入平皿中，平行作2 個平皿。

1.2.3 .2 增加培養(yǎng)基體積法（0.2 ml/皿）取“1.2.2”項下1∶10 的供試液0.2 ml 注入平皿中，平行作10個平皿，作為試驗組、供試品對照組、菌液對照組。

1.2.3 .3 增加稀釋液法試驗組、供試品對照組、菌液對照組操作均同“1.2.3.1”項，但“1.2.3.1”項下的1∶10或1∶100的供試液需換成1∶20或1∶200，1∶50 或1∶500 的供試液。

1.2.3 .4 計算將“1.2.3.1”“1.2.3.2”和“1.2.3.3”項下的平皿按《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1105 要求培養(yǎng)后，試驗組、供試品對照組、菌液對照組測定的菌落數(shù)分別記為A、B、C，按如下公式進(jìn)行計算回收比：回收比R=（A-B）/C。

1.2.4 控制菌檢查方法適用性試驗

1.2.4 .1 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法適用性試驗按《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1106，進(jìn)行供試品的制備和預(yù)培養(yǎng)，分別制備供試品組、陰性對照組、陽性驗證組，混勻，33 ℃培養(yǎng)48 h。然后劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)48 h[10]。若檢不出，則增加腸道菌增菌液體培養(yǎng)基體積，重復(fù)試驗。

1.2.4 .2 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗按《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1106，分別制備供試品組、陰性對照組、陽性驗證組，混勻，33 ℃培養(yǎng)48 h，麥康凱液體及麥康凱瓊脂培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)[10]。若檢不出，則增加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基體積，重復(fù)試驗。

1.2.4 .3 沙門菌檢查方法適用性試驗按《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1106，分別制備供試品組、陰性對照組、陽性驗證組，混勻，33 ℃培養(yǎng)24 h，RV 沙門增菌液及木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)[10]。若檢不出，則增加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基體積，重復(fù)試驗。

2 結(jié)果

2.1 需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果

按照“1.2.3.1”項下常規(guī)法進(jìn)行方法適用性試驗，結(jié)果見表1。只有個別批次的黑曲霉回收比勉強(qiáng)達(dá)到0.5，其他各批次各菌種的回收比均不在0.5～2.0。因此，進(jìn)一步采用增加培養(yǎng)基體積法（0.2 ml/皿）和增加稀釋液法進(jìn)一步進(jìn)行適用性試驗。

表1 常規(guī)法適用性試驗的回收比(n=3)

按照“1.2.3.2”項下增加培養(yǎng)基體積法（0.2 ml/皿）進(jìn)行方法適用性試驗，結(jié)果見表2。所有批次的喘舒片對5 株試驗菌的回收比均在0.5～2 的范圍內(nèi)。

表2 增加培養(yǎng)基體積法適用性試驗的回收比(n=3)

按照“1.2.3.3”項下增加稀釋液法進(jìn)行方法適用性試驗，結(jié)果見表3。當(dāng)需氧菌總數(shù)檢查將供試品稀釋至200 倍，霉菌和酵母菌總數(shù)檢查將供試品稀釋至20 倍時，供試品所有批次的喘舒片對5 株試驗菌的回收比均在0.5～2 的范圍內(nèi)。但多個批次的金黃色葡萄球菌、白念珠菌的回收比勉強(qiáng)達(dá)到0.5，因此，進(jìn)一步增加稀釋液進(jìn)行適用性試驗。

當(dāng)需氧菌總數(shù)檢查用稀釋至500 倍的供試液，霉菌和酵母菌總數(shù)檢查用稀釋至50 倍的供試液時，其計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果見表4，所有批次的喘舒片對5 株試驗菌的回收比均在0.5～2 的范圍內(nèi)。

表4 增加稀釋液法適用性試驗的回收比(n=3)

2.2 控制菌檢查方法適用性試驗結(jié)果

按照“1.2.4”項下控制菌檢查方法進(jìn)行適用性試驗，結(jié)果見表5，其中耐膽鹽革蘭陰性菌和大腸埃希菌檢查試驗中，供試品組和陰性對照組均未見菌落生長；陽性驗證組大腸埃希菌生長良好。沙門菌檢查試驗中，1、3、8 批次喘舒片的陽性驗證組、陰性對照組和供試品組均未見菌落生長，則增加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基體積，重復(fù)試驗。

表5 控制菌檢查方法適用性試驗(n=3)

按照“1.2.4”項下，增加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基體積，進(jìn)一步對1、3、8 批次喘舒片的沙門菌檢查方法適用性試驗結(jié)果見表6。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基體積為200 ml 時，供試品組和陰性對照組均未見菌落生長；陽性驗證組乙型副傷寒沙門氏菌生長良好。

表6 沙門菌檢查方法適用性試驗(n=3)

3 討論

由以上結(jié)果可以看出，喘舒片制劑可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml/皿）或增加稀釋液法進(jìn)行需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)；兩種方法都能很好地去除藥物的抑菌作用，但增加稀釋液法能夠降低檢查成本且操作簡單，筆者建議采用增加稀釋液法；大腸埃希菌和耐膽鹽革蘭陰性菌檢查可采用常規(guī)法進(jìn)行；沙門菌檢查時，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基需增加到200 ml。

比較分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1）不同廠家的喘舒片制劑具有相似的抑菌活性，即對金黃色葡萄球菌、白念珠菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌抑制作用相對較強(qiáng)，對銅綠假單胞菌和黑曲霉的抑制作用較弱。2）不同廠家的喘舒片制劑抑菌活性有細(xì)微差異。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，喘舒片中的4 種原藥材中主要的抑菌成分為大黃和黃芩，且對各種菌的抑菌效果與本文的結(jié)果基本一致。如劉鼎闊等[3]、虞夏暉等[4]采用最小抑菌濃度測定、紙片擴(kuò)散法等研究發(fā)現(xiàn)大黃對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌5 種菌的生長均具有抑制效果。徐令清等[5]、畢月等[6]、董波等[7]的研究發(fā)現(xiàn)大黃中的抑菌成分主要通過破壞菌體細(xì)胞膜和干擾DNA 的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，來抑制細(xì)菌生長、繁殖。

葉英劍等[9]通過加堿溫浸法提取的黃芩甙對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌抑菌作用較強(qiáng)，對沙門氏桿菌抑菌作用相對較弱。王鑫等[10]通過牛津杯法、微量稀釋法測定黃芩各提取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，發(fā)現(xiàn)黃芩水提物的抑菌作用最強(qiáng)，水煎液次之，醇提液效果最差。崔巍[13]的研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷同樣通過增加細(xì)胞膜通透性，使細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)喪失來抑制金黃色葡萄球菌。

微生物限度檢查過程受人、機(jī)、料、法、環(huán)等多種因素影響，工作繁重且重復(fù)勞動量大，且是藥品質(zhì)量控制的重要手段，客觀反映了企業(yè)生產(chǎn)過程質(zhì)量控制的好壞，也是藥品質(zhì)量評價的重要指標(biāo)，因此，建立合理有效的微生物限度檢查方法尤為重要。