黃強燕 李 莉 顧崢嶸 徐晶星 錢怡云 韋 敏 劉旻虹*

白果為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥成熟種子。2020 版《中華人民共和國藥典》記載，白果，甘、苦、澀，平，有毒，歸肺、腎經(jīng)。具有斂肺定喘，止帶縮尿的功效，用于痰多喘咳，帶下白濁，遺尿尿頻等癥狀[1]。目前，白果資源大部分供食用，既在國內(nèi)市場銷售又出口他國，是藥食同源之品，收載于國家衛(wèi)生和計劃生育委員會規(guī)定的藥食兩用中藥品種目錄中?！侗静菡饕吩啤按_有小毒，生食及熟者多食，均易中毒，小兒尤當慎之[2]”?，F(xiàn)代文獻報道，過多食用白果，容易出現(xiàn)驚厥抽搐，甚至死亡，尤其是兒童更易中毒。中毒患者主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸道癥狀，偶有末梢神經(jīng)功能障礙[3]。白果中毒沒有特殊解毒劑，臨床治療白果中毒患者時，對于輕度中毒患者，多采用催吐方法，中、重度中毒患者需進行洗胃，并根據(jù)情況給予地塞米松、鹽酸納洛酮靜脈滴注，適當補充能量合劑與維生素等進行綜合治療[4]。

2020 版《中華人民共和國藥典》中明確提示“生食有毒”，但未見對其毒性成分的限量標準及相關檢測方法。1985年，Wada 等[5]首次從白果中分離得到4’-O-甲基吡哆醇（MPN）或銀杏毒素（ginkgotoxin），并證實其是導致白果急性中毒癥狀的主要毒性物質，之后在銀杏葉中亦發(fā)現(xiàn)這一成分，并廣泛存在于各類銀杏葉制品中[6-7]。Leuendorf 等[8]從銀杏中克隆了基因Gbpdx1，并證實這一基因參與了MPN 結構類似化合物的合成過程，這一基因在銀杏的種子、葉片以及樹干組織中均有表達，尤其在種子的表達最強，這可能是白果種子中MPN 含量較其他部位含量更高的原因之一。

隨著科技的進步及人們對白果安全性的逐步重視，已有多種方法應用到了檢測白果及其制品中的MPN 含量中。然而已建立的熒光檢測、離子對色譜法、氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GC-MS）等檢測方法，對檢測條件的要求較高，推廣應用受到了限制[9-13]。目前，仍然缺乏一種更加便捷準確的檢測方法，對中藥白果中吡哆醇類毒性成分MPN 進行檢測，以此有效監(jiān)管和保證白果及其制品的安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Thermo U3000 美國賽默飛世爾科技有限公司），電子天平（XP105DR，十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司），電子天平（XP504，萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司），超聲波清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）。選定Inertil?ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）為分析色譜柱。

1.2 藥品與試劑

白果（均購自市場）；4’-O-甲基吡哆醇（MPN）對照品（Sigma-Aldrich 公司，批號：89960-BCCD4482）；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertil?ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-10 mmol/L 甲酸銨水溶液（7∶93）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液精密稱取MPN 對照品適量，加甲醇溶解稀釋成對照品貯備液（414.4 μg/ml）。

2.2.2 供試品溶液取樣品粉末（過4 號篩）2.5 g，精密加入純水20 ml，稱定重量，浸泡30 min，超聲提取30 min。用水補足減失的重量，取上清液以0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，精密吸取10 μl 注入高效液相色譜儀。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系的考察精密吸取“2.2.1”項下MPN對照品貯備液適量，稀釋成系列對照品溶液。以進樣濃度X（μg/ml）為橫坐標，色譜峰面積Y 為縱坐標，繪制標準曲線。見表1。

表1 MPN 線性方程

2.3.2 系統(tǒng)適用性實驗取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液按“2.1”項色譜條件進樣測定，記錄色譜。見圖1。在該色譜條件下待測成分能達到基線分離（分離度＞1.5）；其他成分對測定無干擾。

圖1 白果對照品及樣品MPN 分析色譜

2.3.3 定量限與檢測限取對照品溶液（濃度0.103 6 μg/ml），按上述色譜條件下分別進不同體積進行分析。以信噪比為10∶1 時相應濃度計算定量限，以信噪比為3∶1 時相應濃度計算檢測限。MPN 定量限為0.166 μg/g，檢測限為0.066 μg/g。

2.3.4 進樣精密度取對照品溶液（濃度20.72 μg/ml），按上述色譜條件，連續(xù)進樣6 次，計算峰面積的相對標準偏差（RSD）。結果表明：其進樣精密度為0.4%，進樣精密度良好。

2.3.5 重復性取編號8 的白果，按上述供試品溶液的制備方法，平行制備6 份供試品溶液，各精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行分析，測定峰面積，計算含量，結果重復性試驗的RSD 為1.5%，方法的重復性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性取“2.3.5”重復性項下一份溶液，分別于0、1、2、4、6、8、10、12 h 進樣10 μl，記錄峰面積，計算 RSD 為1.9%，結果表明穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率精密吸取“2.2.1”項下對照品貯備液7 ml 加水稀釋至500 ml，作為加標對照溶液。取白果熟粉（過4 號篩，MPN 含量104.852 μg/g）取約1.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入20 ml 加標對照溶液，稱定重量，浸泡30 min，超聲提取30 min。用水補足減失的重量，取上清液以0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。精密吸取供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算回收率，平均回收率為90.79%，均在80%～120%，平均RSD 為1.4%。

2.4 樣品含量測定

取樣品12 批，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。見表2。

表2 12 批次樣品中MPN 測定結果

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

MPN 是白果中主要的吡哆醇類毒性成分，由于MPN 的親水性較強，故其在色譜系統(tǒng)的保留較差。為此，通過在流動相中加入離子對試劑或利用三氟醋酐對MPN 進行衍生化以克服這一缺點。故本實驗前期考察了流動相乙腈與10 mmol/L 甲酸銨水溶液，流動相流速（0.8 ml/min 和1.0 ml/min），柱溫（15 ℃、25 ℃、35 ℃和40 ℃），發(fā)現(xiàn)色譜條件為1.0 ml/min乙腈-10 mmol/L 甲酸銨水溶液（7∶93），柱溫30 ℃時，目標峰峰型較好，且均能達到較好的分離效果、純度等要求。在此檢測條件下，MPN 在220、256、328 nm 處有最大吸收，為獲得更好的峰型及更準確的實驗結果，本研究采用220 nm 作為含量測定的檢測波長。不同品牌高效液相（Waters e2695、島津LC-20A、Agilent1200）、不同品牌4.6×250 mm，5 μm的色譜柱（島津的Inertil?ODS-SP 或AtlantisTMT3色譜柱）均能使目標峰達到較好的分離效果、純度等要求。

3.2 前處理方法的考察

經(jīng)查閱相關文獻資料，MPN 親水性較強，在供試品溶液制備過程前期，考察了不同的提取溶劑：水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、純甲醇、95%乙醇超聲處理30 min 后進樣，實驗結果表明以水為提取溶劑含量測定結果較高。同時考察了不同提取時間，如超聲30 min、超聲1 h、浸泡30 min 后超聲30 min、浸泡45 min 后超聲30 min，結果表明浸泡30 min 后超聲30 min，可達到較為滿意的提取效果。

另外實驗過程中發(fā)現(xiàn)MPN的含量與藥材粉碎的粗細程度密切相關，故分別采用了粉碎后不過篩網(wǎng)、過3 號篩網(wǎng)、過4 號篩網(wǎng)、過5 號篩網(wǎng)的樣品進行制備供試品溶液，發(fā)現(xiàn)過4 號篩網(wǎng)的樣品含量最高，且操作簡便，最終確定了上述供試品溶液提取方法。