黃校樑 李幗寧 何杏欣 莫桂芳 許敏華

佛山復(fù)星禪誠醫(yī)院檢驗科，廣東佛山 528031

碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenemresistant，CRE）屬于腸道桿菌，生物學(xué)形狀以及形態(tài)均存在較高的相似度，OXA-48酶、MβL酶、KPC酶等碳青霉烯酶等為腸桿菌科細(xì)菌對耐碳青霉烯類抗生素的主要機(jī)制，整合子、質(zhì)粒等移動元件傳播均可成為傳播介質(zhì)并最終造成菌株CRE暴發(fā)[1-2]。針對產(chǎn)生不同碳青霉烯酶的CRE菌株需要采用相應(yīng)的藥物治療方案，其中，阿維巴坦可對A類（ESBL、KPC）、C類（AmpC）以及D類（OXA-48）β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌生長產(chǎn)生抑制作用，但對產(chǎn)生B類金屬酶（NDM、IMP）無明顯效果[3]?，F(xiàn)階段，碳青霉烯類抗生素在臨床上應(yīng)用廣泛且存在濫用現(xiàn)象，兒童體內(nèi)對碳青霉烯類抗生素耐藥菌株不斷出現(xiàn)，要求臨床微生物實驗室能夠?qū)μ记嗝顾仡愋瓦M(jìn)行快速且準(zhǔn)確地鑒別，以便為臨床合理選擇抗菌藥物提供指導(dǎo)，以最大程度地抑制CRE傳播[4]。本研究對象為兒科患者，探討自CRE中分離出的碳青霉烯酶類型及分布情況，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

共計采集2018年6月至2019年10月非重復(fù)CRE菌株240株，其中，肺炎克雷伯菌183株，大腸桿菌30株，陰溝腸桿菌20株，產(chǎn)氣克雷伯菌7株。CRE為對超過1種碳青霉烯類（包括厄他培南、亞胺培南、美羅培南等）存在耐藥現(xiàn)象的腸桿菌科細(xì)菌[5]。菌株鑒定儀器為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（型號：MALDI-TOF MS），質(zhì)控菌株：大腸桿菌ATCC 25922，來自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 檢測方法

1.2.1 儀器、試劑 儀器包括購自德國Bruker公司的MALDI-TOFMS，購自德國Eppendor公司的PCR擴(kuò)增儀、電泳儀，所用紫外線投射凝膠成像儀型號為GelDoc2000，由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。試劑包括，Taq酶；購自法國梅里埃公司的MH平板；dNTPs10×緩沖液，由大連TaKaRa公司生產(chǎn)；由西班牙Biowest公司生產(chǎn)的瓊脂糖；由北京天根公司生產(chǎn)的核酸染料：型號為Genegreen、DL2000Marker、50×TAE緩沖液、由大連美侖生物公司生產(chǎn)的抗菌藥物粉劑；由英國MAST公司生產(chǎn)的MAST D73C組合紙片、哥倫比亞血平板。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 碳青霉烯酶基因檢測方法 通過煮沸法進(jìn)行細(xì)菌DNA檢測并以之作為PCR模板[6]，對碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaOXA-48-like、blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaAIM、blaGIM、blaBIC、blaSIM）進(jìn) 行 擴(kuò)增，以下為引物序列：基因包括A類β-內(nèi)酰胺酶 基 因：KPC、TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、IBC、GES；B類β-內(nèi)酰胺酶基因：IMP、VIM；C類β-內(nèi)酰胺酶基因：DHA、ACC、FOX；D類β-內(nèi) 酰 胺 酶 基 因：OXA-2、OX1-A（OXA-10）[6]。共計25 μl反應(yīng)體系，包括1 μl DNA模板、各0.5 μl 20 μmol/L上下游引物、2.5 μl 10×緩 沖 液、2 μl dNTPs及18.375 μl ddH2O。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳（含Genegreen核酸染料）對產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增并成像（通過紫外投射凝膠成像系統(tǒng)拍照）成像。針對陽性擴(kuò)增產(chǎn)物測序（上海賽音生物技術(shù)有限公司）后將測序結(jié)果提交至blast網(wǎng)站（https: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.2.2.2 碳青霉烯酶 MAST D73C組合紙片法包括以下方面：將法羅培南歸入至A組，將法羅培南與MβL抑制劑歸入至B組，將法羅培南與KPC抑制劑歸入至C組，經(jīng)法羅培南聯(lián)合AmpC抑制劑歸入至D組，將替莫西林聯(lián)合MβL抑制劑歸入至E組。根據(jù)CLSI M02文件及常規(guī)紙片擴(kuò)散法中相關(guān)操作要求向涂布受試菌的MH平板中放入紙片并輕微按壓，控制孵育溫度為35℃，孵育時間為18～24 h，然后測量抑菌圈直徑[7]。陽性質(zhì)控菌株：經(jīng)PCR確認(rèn)攜帶blaNDM、blaOXA-232、blaKPC基因的細(xì)菌，陰性質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

比較分析碳青霉烯酶基因PCR檢測結(jié)果及碳青霉烯酶組合紙片法檢測結(jié)果。靈敏度=陽性菌株數(shù)/（陽性菌株數(shù)+陰性菌株數(shù)）×100%，特異度=陰性菌株數(shù)/（陽性菌株數(shù)+陰性菌株數(shù)）×100%。檢測金標(biāo)準(zhǔn)為PCR檢測結(jié)果，對組合紙片法在碳青霉烯酶中的檢測特異度、靈敏度進(jìn)行計算并分析與PCR結(jié)果的一致性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件，一致性差：Kappa值＜0.4；一致性較好：Kappa值介于0.4～0.75；一致性好：Kappa值＞0.75。Youden指數(shù)范圍介于0～1，指數(shù)越接近1則表明具有越好的真實性。

2 結(jié)果

2.1 碳青霉烯酶基因PCR檢測結(jié)果分析

240株CRE中，PCR基因檢測結(jié)果顯示檢出碳青霉烯酶基因菌株數(shù)量為233株，blaNDM、blaOXA-232、blaKPC-2和blaIMP檢出率分別為40.83%、29.17%、20.83%和4.58%，其中，4株菌株同時攜帶2種碳青霉烯酶基因，7株菌株未檢測到碳青霉烯酶基因。碳青霉烯酶基因檢出情況及不同基因型分布情況見表1。

表1 碳青霉烯酶基因型分布情況分析（n=240）

2.2 碳青霉烯酶組合紙片法檢測結(jié)果分析

單碳青霉烯酶基因表達(dá)陽性的菌株數(shù)量為231株，MAST D73C組合紙片檢測結(jié)果如下：MβL酶檢出率為47.16%（108/229）、OXA-48酶檢出率為27.07%（62/229）和KPC酶檢出率為8.73%（20/229）。檢測結(jié)果金標(biāo)準(zhǔn)為PCR檢測結(jié)果，以MAST D73C檢測MβL酶及OXA-48酶靈敏度、特異度，靈敏度＞80%，特異度＞95%。Youden指數(shù)、Kappa值表明區(qū)分產(chǎn)MβL酶和OXA-48酶菌株均具有較好的真實性與一致性。KPC酶檢測特異度與靈敏度分別為98.85%、32.14%，一致性及真實性均較差。通過MAST D73C組合紙片法共計檢出CRE 39株，無法對獲取的結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確解釋，PCR確認(rèn)31株CRE產(chǎn)KPC酶菌株、產(chǎn)OXA-48酶CRE數(shù)量為8株。見表2～3。

表2 PCR及MAST D73C在碳青霉烯酶型中的檢測結(jié)果比較

2.3 分析組合紙片法在KPC型碳青霉烯酶中的補充標(biāo)準(zhǔn)

因MAST D73C在KPC型碳?xì)涿钢械臋z測靈敏度不高，綜合PCR基因檢測結(jié)果及本試驗數(shù)據(jù)，無法對此次檢測結(jié)果做出準(zhǔn)確解釋，若B-A、C-A及D-A不足5 mm，E超過10 mm，若對法羅培南耐藥則可判定為產(chǎn)KPC酶，可使KPC酶檢測靈敏度得到顯著提高（由32.14%提高至85.71%），特異度為99.43%。本研究中，Youden指數(shù)及Kappa值分別為0.86、0.91，一致性及真實性均較高，其他酶型的特異度、靈敏度變化不明顯，MAST D73C碳青霉烯酶與PCR檢測符合率較高，達(dá)91.27%。

表3 MAST D73C在碳青霉烯酶型中的檢測價值

3 討論

隨著對兒童健康和生命造成極大威脅的CRE發(fā)現(xiàn)越來越多，引起了世界范圍的廣泛關(guān)注[8]。在臨床實踐中掌握碳青霉烯酶種類能為臨床選擇合適的抗生素提供指導(dǎo)，可切斷病原菌傳播途徑并且縮小擴(kuò)散范圍[9]。既往研究中，NDM-1酶在各年齡段人群中均能夠檢出，其中兒童占比較高，而且由于NDM-1酶耐藥性較廣，一旦感染可導(dǎo)致治療難度顯著增加，故而有“超級細(xì)菌”之稱[10]。KPC酶在成人分離株中的檢出率較高，但是本研究中兒童分離株較少。此外，本研究中OXA-232主要自肺炎克雷伯菌中檢測到[11]，它是OXA-48的變體。OXA-48于2001年自土耳其檢出，容易引起流行病傳播，該菌株幾乎對碳青霉烯類、頭孢菌素類以及青霉素類等幾乎所有β-內(nèi)酰胺類藥物存在耐藥性[12-13]，故而臨床應(yīng)及時監(jiān)測并及時進(jìn)行有效防控[14]。OXA-48酶常規(guī)表型檢測存在較高的風(fēng)險，需要采用其他檢測方法對產(chǎn)OXA-48酶菌株，確保能夠在短時間內(nèi)迅速獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，常用方法包括改良Hodge試驗、改良碳青霉烯滅活試驗、Carba NP試驗等，適宜于基層微生物室中開展。

有研究報道[15]MAST D73C能夠不斷準(zhǔn)確判斷碳青霉烯酶類型，還能夠?qū)XA-48酶、MβL酶及KPC酶進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，但本研究中針對大部分產(chǎn)KPC酶菌株的CA＜5 mm結(jié)果均無法獲得準(zhǔn)確解釋，KPC酶檢測靈敏度僅為32.14%。Youden指數(shù)以及kappa值結(jié)果均表明MAST D73C紙芯片組合能夠準(zhǔn)確區(qū)分MβL、OXA-48產(chǎn)酶菌株，而且具有較高的一致性和真實性，但是難以準(zhǔn)確區(qū)分KPC產(chǎn)酶菌株（Youden指數(shù)：0.32，kappa值：0.42），原因可能在于KPC酶檢測靈敏度低并導(dǎo)致可靠性下降，C組紙片中的KPC抑制劑濃度無法有效抑制碳青霉烯類高度耐藥菌株中的KPC酶作用可能為重要引發(fā)原因。PCR檢測結(jié)果表明8個結(jié)果不明確的CRE菌株產(chǎn)生OXA-48酶，可解釋組合紙片檢測OXA-48類酶檢測靈敏度低于100%。MAST D73C在KPC酶檢測中的應(yīng)用價值也存在一定的局限性，表現(xiàn)為檢測靈敏度低，依照PCR結(jié)果與實驗室數(shù)據(jù)制訂KPC型碳青霉烯酶補充標(biāo)準(zhǔn)后能夠使檢測靈敏度獲得提高，而且不會影響其他酶型的檢測特異度及靈敏度，能夠有效指導(dǎo)實驗室實施此類檢測。

目前CRE治療難度仍然較大，針對碳青霉烯類耐藥現(xiàn)象仍然急需創(chuàng)新藥物以有效控制患者病情，保證患者生命安全。鑒定碳青霉烯類既能夠為流行病學(xué)研究及制訂相關(guān)控制策略提供一定的參考和指導(dǎo)，還能夠指導(dǎo)臨床合理用藥。MAST D73C組合紙片法可指導(dǎo)臨床準(zhǔn)確判斷碳青霉烯酶類型，有利于臨床合理選擇抗菌藥物。