楊 麗 賴燁才 伍雙茜 陳婉榕

廣州白云山醫(yī)藥集團股份有限公司白云山制藥總廠，廣東廣州 510515

頭孢克肟（cefixime）為第三代頭孢菌素類抗生素，由日本藤澤制藥于20世紀80年代研發(fā)成功并應(yīng)用于臨床，其對革蘭陰性菌有較強的抗菌活性，對多種革蘭陽性菌尤其是葡萄球菌抗菌活性較低[1-2]。頭孢克肟能與青霉素結(jié)合蛋白（PBP）相結(jié)合，抑制細菌細胞壁肽聚糖的合成，從而破壞細菌分裂，起抗菌作用[3-4]。目前市場上頭孢克肟的劑型很多，但有關(guān)微生物限度檢查方法研究比較少，且已不適用于新版藥典要求，因此建立此類藥物合適的微生物限度檢查方法是有必要的。在探索頭孢克肟片微生物限度檢查方法適用性時，只有通過消除其抑菌活性而建立的方法，才能真實反映其微生物污染情況，防止出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這對該產(chǎn)品生產(chǎn)放行、有效期存放和企業(yè)微生物控制體系建立[5]具有重大意義。本研究依照《中華人民共和國藥典》（縮寫為“ChP”）2020年版四部[6]進行方法適用性試驗，通過利用β-內(nèi)酰胺酶（頭孢菌素酶）[7-8]與頭孢類藥物結(jié)合使其抗菌活性降低，結(jié)合薄膜過濾法、延長酶作用時間、不影響檢驗標(biāo)準(zhǔn)選擇更高稀釋級等方法，發(fā)揮協(xié)同作用而去除樣品的抑菌性，從而為頭孢克肟片的微生物限度檢查提供合理、有效和可行的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BSC-1600IIA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；EZ-FIT微生物過濾三聯(lián)支架（美國默克密理博）；BCE822-1CCN電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BSP-250生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；IN812C低溫培養(yǎng)箱（廣州貝特生物科技有限公司）；XG1.DTED-0.6D脈動真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）。

1.2 樣品與培養(yǎng)基

頭孢克肟片（白云山制藥總廠，批號：02210201-1、02210801、02210802，規(guī)格：0.1 g）；頭孢菌素酶（≥210萬單位/5 ml，蘇州普今生物科技有限公司，批號：2103020）。

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]、麥康凱液體培養(yǎng)基（MacB）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacA）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、0.1%無菌蛋白胨水溶液（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），培養(yǎng)基適用性試驗均符合ChP 2020年版規(guī)定。

1.3 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球 菌[CMCC（B）26003]、銅 綠 假 單 胞 菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

按ChP 2020年版四部制備金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、大腸埃希菌的102～104cfu/ml的菌懸液，進行活菌計數(shù)備用。

2.2 供試液制備

取供試品10 g，放入預(yù)熱不超過45℃ pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，振搖混勻，靜置5 min，取上層溶液[9]作為1∶10供試液，并用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋為1∶100的供試液。

2.3 微生物計數(shù)方法適用性試驗

2.3.1 需氧菌總數(shù)

2.3.1.1 方法適用性預(yù)試驗 方案Ⅰ：取1∶10供試液10 ml，分別加入0.1 ml金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌菌懸液混勻（≤100 cfu/ml），將含菌供試液1 ml加至100 ml 45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液中經(jīng)薄膜過濾后，再用45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液（100 ml/次），總量分別為300、500、700 ml沖洗，濾干后取出濾膜，貼于約含20 ml TSA（含頭孢菌素酶300萬單位/100 ml TSA）并凝固的平皿上。

方案Ⅱ：取1∶100供試液10 ml，加入0.1 ml金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌菌懸液混勻（≤100 cfu/10 ml），將含菌供試液10 ml加至100 ml 45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液中經(jīng)薄膜過濾后，用45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液（100 ml/次），總量為500 ml沖洗，濾干后取出濾膜，貼于約含20 ml TSA（含頭孢菌素酶300萬單位/100 ml TSA）并凝固的平皿上。

方案Ⅰ和Ⅱ分別以同法測定菌液組和供試品對照組，分別計算回收比值。各平皿于32℃倒置培養(yǎng)3 d，逐日觀察。

結(jié)果顯示，采用方案Ⅰ和300、500、700 ml沖洗量，銅綠假單胞菌回收比值分別為0.33、0.41、0.43，枯草芽孢桿菌回收比值分別為0.20、0.35、0.41，均＜0.5；采用方案Ⅱ和500 ml沖洗量，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌回收比值分別為0.81、0.92和0.93，均在藥典規(guī)定的0.5～2.0之間。見表1。

表1 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌預(yù)試驗回收比值

2.3.1.2 方法適用性試驗 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，方案Ⅱ是可行的，因此本試驗按照方案Ⅱ采用3批次樣品，以及ChP規(guī)定的5種需氧菌進行計數(shù)方法適用性試驗，并設(shè)菌液組、供試品對照組以及滅活劑對照組。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，對ChP規(guī)定的5種需氧菌進行3批次的計數(shù)方法適用性試驗，結(jié)果顯示，試驗組和滅活劑對照組中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌回收比值均＞0.90，均在ChP規(guī)定的0.5～2.0之間，故可照該供試品制備方法和計數(shù)方法測定頭孢克肟片的需氧菌總數(shù)。見表2。

表2 需氧菌總數(shù)和滅活劑對照組回收比值

2.3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)方法適用性試驗 頭孢克肟屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，具有較強的抗細菌活性，但對真菌（霉菌和酵母菌）基本無抗菌活性[9-11]，所以采用平皿法對其進行檢查方法適用性試驗。取1∶10供試液1 ml按照ChP 2020年版1105要求對3個不同批次進行試驗。結(jié)果顯示，霉菌和酵母菌總數(shù)按照平皿法操作，3批次白色念珠菌回收比值均為0.92，黑曲霉菌回收比值分別為0.92、0.92和0.90，均在ChP規(guī)定的0.5～2.0之間，故此方法測定頭孢克肟片的霉菌和酵母菌總數(shù)有效、可行。見表3。

表3 霉菌和酵母菌總數(shù)回收比值

2.4 控制菌（大腸埃希菌）檢查方法適用性試驗

方案①：取1∶10供試液10 ml，加至100 ml 45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液混勻，全量經(jīng)濾膜過濾，再用45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液適量（約100 ml/次），總量為500 ml，在最后100 ml沖洗液中加入1 ml大腸埃希菌菌懸液（≤100 cfu/ml），濾干，取出濾膜接入不少于100 ml TSB（含頭孢菌素酶60萬單位/100 ml TSB）中。

方案②：取1∶10供試液10 ml，加至100 ml 45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液混勻，全量經(jīng)濾膜過濾，再用45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液適量（約100 ml/次），總量為300 ml，在最后100 ml沖洗液中加入1 ml大腸埃希菌菌懸液（≤100 cfu/ml），并在最后20 ml沖洗液中加入酶活力不少于60萬單位的頭孢菌素酶，濾干，取出濾膜接入不少于100 ml TSB（含頭孢菌素酶60萬單位/100 ml TSB）中。

方案③：取1∶10供試液10 ml，加至100 ml 45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液混勻，全量經(jīng)濾膜過濾，再用45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液適量（100 ml/次，總量為300 ml，在最后100 ml沖洗液中加入1 ml大腸埃希菌菌懸液（≤100 cfu/ml），并在最后20 ml沖洗液中加入酶活力不少于60萬單位的頭孢菌素酶，靜置10 min后濾干，取出濾膜接入不少于100 ml TSB（含頭孢菌素酶60萬單位/100 ml TSB）中。

方案①、②和③的試驗組均采用3個不同批次進行試驗，并分別設(shè)立陽性對照組和陰性對照組，培養(yǎng)物于32℃培養(yǎng)至規(guī)定時間。結(jié)果顯示，采用方案①和方案②，3批次試驗組中均有1批次未檢出大腸埃希菌，方案③中3批次均可檢出大腸埃希菌，故可用方案③控制菌檢查法進行頭孢克肟片的大腸埃希菌檢查。見表4。

表4 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗結(jié)果

3 討論

徐秋萍等[12]建立頭孢克肟顆粒的微生物限度檢查方法，需氧菌計數(shù)是供試液經(jīng)薄膜過濾法后再加入試驗菌株，這種加菌方法已不適合現(xiàn)行ChP要求。本研究先接種試驗菌于供試液[13]，采用薄膜過濾法、滅活劑及作用時間、選用更高稀釋級聯(lián)合應(yīng)用，消除或減弱頭孢克肟的抑菌作用，建立的方法可確保在檢查時能檢出樣品真實微生物含量。

通過薄膜過濾法可將供試品中抑菌成分有效去除，促進供試品污染微生物生長和繁殖。本研究采用薄膜過濾法減弱本品的抑菌活性，降低對各試驗菌的影響；試驗采用1∶10含菌供試液用薄膜過濾法，沖洗液量多至700 ml時，銅綠色假單胞菌和枯草芽孢桿菌回收比值仍低于0.5，可見頭孢克肟對這兩種菌株有較強的抑菌作用，表明1∶10供試液不適合用于需氧菌計數(shù)檢查。

加入適宜的滅活劑以及采用供試液的更高稀釋級進行需氧菌計數(shù)。滅活劑添加到?jīng)_洗液或培養(yǎng)基中能鈍化、中和供試品抑菌活性，進一步消除其抑菌成分；另外由于頭孢克肟片是口服制劑，在不影響結(jié)果判斷情況下，可采用使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行計數(shù)試驗。本研究需氧菌計數(shù)采用1∶100含菌供試液[14]經(jīng)薄膜過濾法沖洗，并加頭孢克肟的滅活劑β-內(nèi)酰胺酶[15]約60萬單位于平皿培養(yǎng)基中，各菌株回收比值均在0.5～2.0之間，符合ChP規(guī)定。

延長滅活劑作用時間[16]，頭孢菌素酶是一種蛋白質(zhì)，分子直徑大約在1～100 nm之間，遠低于常用截留需氧菌的濾膜孔徑（0.45 μm），因此在大腸埃希菌檢查方法適用性試驗中，在最后20 ml沖洗液中加入頭孢菌素酶靜置10 min，便于酶與殘留于濾膜上的頭孢克肟充分反應(yīng)，有效去除樣品的抑菌性，更有利于檢出大腸埃希菌。

藥物微生物限度檢查方法適用性試驗的目的，首先是要為藥物制劑尋求一個具有專屬性、有效性和可行性的檢查方法；其次是方法操作要簡單，檢查成本低、污染風(fēng)險低，能滿足企業(yè)常規(guī)化的微生物檢驗。本研究通過采用多種方法相結(jié)合來建立頭孢克肟片微生物限度檢查方法，所建立的試驗方法操作方便，對不同廠家生產(chǎn)的頭孢克肟原料和制劑的微生物限度檢查方法具有一定的參考價值。