高 喬 張潤濤 劉 聰 李 佳 節(jié)笑笑 倪 艷 康 永▲ 楊黎彬 韓文霞李偉澤

1.山西省中醫(yī)藥研究院，山西太原 030012；2.江蘇微納醫(yī)藥科技有限公司，江蘇揚中 212218

陰道炎是陰道發(fā)生炎癥后導致外陰出現(xiàn)瘙癢、灼痛、異味、刺激和異常分泌物的一類病癥，其常見的類型有霉菌性陰道炎、細菌性陰道炎、萎縮性陰道炎（老年性陰道炎）以及滴蟲性陰道炎[1]。陰道炎的發(fā)生多為陰道加德納菌（gardnerella vaginalis，GV）為主的厭氧菌增殖狀態(tài)異常，并伴隨陰道微環(huán)境中優(yōu)勢桿菌如乳桿菌的減少，從而引起陰道菌群構(gòu)成發(fā)生改變[2]。研究調(diào)查資料顯示，陰道炎的發(fā)生率為20%～60%，該病對女性的日常生活和心理有很大的負面影響，得病后易表現(xiàn)出焦慮、羞愧以及對個人衛(wèi)生等癥狀反復(fù)出現(xiàn)的擔憂[3]。臨床上治療陰道炎多以口服加外用甲硝唑等抗生素為主，外用抗生素類藥物在治療過程中容易引起陰道微生態(tài)紊亂的情況[4]。

葡甘露聚糖凝膠[5]（專利號：ZL202010787982.9）是一種由中藥積雪草、白及、蛇床子提取物制成，為治療婦科炎癥而正在研制的復(fù)方中藥新藥，具有黏附性高且作用持久的優(yōu)點，本研究通過建立混合感染性陰道炎模型，來研究該藥物治療陰道炎的效果。

1 材料與方法

1.1 藥物及菌株

葡甘露聚糖凝膠[5]（江蘇微納醫(yī)藥科技有限公司提供，批號：20201109）；空白凝膠基質(zhì)（江蘇微納醫(yī)藥科技有限公司提供，批號：20201109）；復(fù)方甲硝唑陰道栓（河北金牛原大藥業(yè)科技有限公司，批號：09200912）；苯甲酸雌二醇（上海全宇生物科技動物藥業(yè)有限公司，批號：201203）；氫化可的松（上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：019200301）；金黃色葡萄球菌（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號：21031627）；大腸桿菌（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號：20122915）；白色念珠菌（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號：20120208）。

1.2 動物

健 康SD（sqrague dawley）大 鼠，SFP級，雌性，體重170～190 g，由中國食品藥品檢定研究院提供，許可證號：SCXK（京）2017-0005，批號：No.111251210100065347。

1.3 試劑

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試 劑 盒（Bio-Swamp，批 號：No.202104）；白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（Bio-Swamp，批號：No.202104）；白介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（Bio-Swamp，批號：No.202104）；白介素-8（interleukin-8，IL-8）ELISA試劑盒（Bio-Swamp，批號：No.20215）；表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）ELISA試劑盒（Bio-Swamp，批號：No.202104）。

1.4 儀器

C5微孔板檢測儀（美國伯騰）；LEICA RM2125石蠟切片機（萊卡上海分公司）；PM.10AD光學顯微鏡（日本Olympus）；KDC-2046低速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；KP-XW80旋渦混合儀Vortex（凱普生物科技有限公司）；Microfuge 20R離心機（BECKMAN COULTER）。

1.5 倫理

本研究所用動物及相關(guān)處置符合動物倫理的要求，實驗開展前已經(jīng)過本機構(gòu)動物倫理委員會的倫理審查，倫理審查編號：CIRP-IACUC-（G）2022072。

1.6 方法

1.6.1 動物分組及模型[6]建立 菌株常規(guī)培養(yǎng)、傳代后，進行菌液的制備，菌液濃度調(diào)整至2×108CFU/ml，將三種菌液按1∶1∶1比例進行混合備用。

將70只雌性SD大鼠進行為期一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，采用隨機數(shù)表法將70只大鼠分為空白組（10只）和給藥組（60只），將給藥組大鼠進行混合感染性陰道炎模型的建立。造模大鼠進行皮下注射苯甲酸雌二醇注射液2 mg/kg，2 d/次，連續(xù)3次，使大鼠出現(xiàn)假動情期。次日開始每只大鼠皮下注射氫化可的松注射液60 mg/kg，每日1次，連續(xù)3 d，復(fù)制大鼠免疫功能低下模型。之后將已制備好的金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌菌懸液按照1∶1∶1混合，用1 ml注射器接灌胃針，吸取菌懸液0.2 ml/只注入造模大鼠陰道內(nèi)，隔日一次，共3次，注入后在陰道口塞入棉球防止菌液流出。第3次感染24 h后，用無菌棉簽沾取陰道分泌物分別涂于營養(yǎng)瓊脂平皿和沙氏葡萄糖瓊脂平皿表面，常規(guī)培養(yǎng)24 h后平板上肉眼觀察可見大小不等的細菌菌落，即證明感染成功。造模結(jié)束后，將造模成功的60只大鼠使用隨機數(shù)表法分為模型組、復(fù)方甲硝唑組、凝膠基質(zhì)組、葡甘露聚糖凝膠高、中、低劑量組，每組各10只雌鼠。

1.6.2 動物給藥 造模結(jié)束后開始陰道內(nèi)灌注給藥，復(fù)方甲硝唑組給予復(fù)方甲硝唑陰道栓0.4 g/kg，葡甘露聚糖凝膠高、中、低劑量組給予1.2、0.6、0.3 g/kg，凝膠基質(zhì)組給予中劑量同體積量葡甘露聚糖凝膠基質(zhì)，空白組給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥1周。

1.6.3 大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、EGFR含量檢測 末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液對各組大鼠進行麻醉，腹主動脈取血至EP管中，置于室溫放置2 h后，3000 r/min離心20 min，取上清后，制備血清，-20℃保存。ELISA法通過微孔板檢測儀測定大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、EGFR的含量。

1.6.4 大鼠陰道黏膜組織病理學變化 取宮頸組織，立刻置于10%的福爾馬林中固定，石蠟包埋，進行橫切面切片，HE染色，200、40倍光鏡觀察宮頸組織病理形態(tài)學變化。

1.7 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件計算并分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩分別比較采用LSD-t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜ 0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量比較

模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8大于空白組大鼠，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）；給藥后，葡甘露聚糖凝膠各劑量組、復(fù)方甲硝唑組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8均小于模型組大鼠，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）；凝膠基質(zhì)組與模型組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）；葡甘露聚糖凝膠高劑量組與中劑量組血清中TNF-α、IL-6、IL-8小于復(fù)方甲硝唑組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量比較（pg/ml，±s）

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量比較（pg/ml，±s）

注 與空白組比較，aP＜ 0.01；與模型組比較，bP＜ 0.01；與復(fù)方甲硝唑組比較，cP＜ 0.05，dP＜ 0.01；TNF-α：淋巴毒素；IL-1β：白介素-1β；IL-6：白介素-6；IL-8：白介素-8

組別 n 劑量（g/kg） TNF-α IL-1β IL-6 IL-8空白組 10 110.01±6.43 13.89±1.05 33.24±2.99 157.69±16.78模型組 10 169.80±7.50a 65.81±3.70a 84.59±3.64a 256.44±8.59a復(fù)方甲硝唑組 10 0.4 136.80±10.44b 39.68±7.32b 55.42±4.18b 198.04±9.10b葡甘露聚糖凝膠10 1.2 125.25±2.44bc 29.59±2.53b 41.31±2.82bd 171.24±5.32bd 10 0.6 128.88±6.58bc 37.16±3.37b 46.60±4.79bc 180.75±16.66bc 10 0.3 140.28±6.87b 50.77±1.84b 60.22±6.42b 199.29±3.22b凝膠基質(zhì)組 10 161.02±9.83 67.71±2.36 81.31±5.71 246.72±15.78 F值 45.028 166.457 110.654 58.237 P值 0.002 0.003 0.005 0.006

2.2 各組大鼠血清中EGFR含量比較

模型組血清中EGFR含量明顯小于空白組大鼠，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）；給藥后，葡甘露聚糖凝膠各劑量組、復(fù)方甲硝唑組大鼠血清中EGFR含量均大于模型組大鼠，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）；凝膠基質(zhì)組與模型組血清中EGFR含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）；葡甘露聚糖凝膠高劑量組及中劑量組血清中EGFR含量大于復(fù)方甲硝唑組大鼠，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），見表2。

表2 各組大鼠血清中EGFR含量比較（ng/ml，±s）

表2 各組大鼠血清中EGFR含量比較（ng/ml，±s）

注 與空白組比較，aP ＜ 0.01；與模型組比較，bP＜ 0.01；與復(fù)方甲硝唑組比較，dP＜ 0.01；EGFR：表皮生長因子

組別 n 劑量（g/kg） EGFR空白組 10 3.35±0.16模型組 10 1.53±0.08a復(fù)方甲硝唑組 10 0.4 2.50±0.19b葡甘露聚糖凝膠 10 1.2 3.01±0.12bd 10 0.6 2.88±0.05bd 10 0.3 2.57±0.07b凝膠基質(zhì)組 10 1.66±0.15 F值 177.563 P值 0.005

2.3 各組混合感染性陰道炎模型大鼠陰道黏膜組織病理形態(tài)學

光鏡（40、200倍）下大鼠混合感染性陰道炎模型陰道黏膜組織進行病理形態(tài)學檢查：空白組陰道被覆鱗狀上皮，上皮細胞排列緊密，形態(tài)正常，腸腔可見大量壞死細胞碎屑，考慮為陰道上皮周期性變化的產(chǎn)物，非病變所致，固有層膠原豐富，排列緊密，見極少量炎性散在浸潤。模型組陰道被覆鱗狀上皮，上皮細胞排列緊密，上皮可見少量中性粒細胞，為陰道上皮周期性變化中的正?，F(xiàn)象，固有層水腫，結(jié)締組織排列疏松，伴較多炎性細胞散在浸潤，與空白組比較，炎癥反應(yīng)明顯加重。葡甘露聚糖凝膠高、中劑量組陰道被覆鱗狀上皮，上皮細胞排列緊密，上皮可見少量中性粒細胞，為陰道上皮周期性變化中的正常現(xiàn)象，固有層膠原豐富，排列緊密，見極少量炎性散在浸潤。見圖1～2。

圖1 各組混合感染性陰道炎模型大鼠陰道黏膜組織病理形態(tài)學（HE染色，200×）

圖2 各組大鼠陰道黏膜組織病理形態(tài)學（HE染色，40×）

3 討論

在健康的育齡女性中，典型的陰道微生物區(qū)系包括需氧菌群、兼性厭氧菌和專性厭氧菌，大多數(shù)女性的陰道微生物群以乳酸菌為主[7]。在很多情況下，陰道感染的局部治療與口服治療相比效果相當甚至效果更好，局部給藥后藥物作用更為直接且濃度更高，藥物相互作用更少，副作用更少。此外，微生物對抗生素藥物耐藥性的出現(xiàn)、控制感染復(fù)發(fā)的困難以及傳統(tǒng)劑型存在陰道滯留率低和不適的問題支持了對更有效的局部治療的需要[8]。陰道炎是一種陰道黏膜和黏膜下結(jié)締組織的炎癥，陰道炎患者的陰道微生物區(qū)系以一些需氧細菌為主，如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌[9]。陰道炎可能發(fā)展到子宮深部感染，嚴重者可導致孕婦早產(chǎn)[10]。陰道炎相關(guān)的致病細菌已被證明通過樹突狀細胞成熟誘導免疫激活，并增加促炎細胞因子的水平，從而導致生殖道黏膜炎癥[11-12]。在EGFR基因缺失的小鼠中，小鼠傷口表現(xiàn)出異常強烈和彌漫性的炎癥細胞浸潤，這表明EGFR在慢性炎癥性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。

雖然在臨床上常使用抗菌藥物治療，但目前尚無標準的治療方法[14]。然而，頻繁和長時間使用廣譜抗生素可能會導致諸多更為嚴重的不良反應(yīng)，如陰道菌群失調(diào)、繼發(fā)感染和耐藥性[15]。陰道炎屬于中醫(yī)“帶下病”范疇，《傅青主女科》曰：“夫帶下俱是濕癥”，因此帶下病的病因以濕邪為主，治法宜清熱利濕泄?jié)醄16-20]。葡甘露聚糖凝膠是一種由中藥積雪草、白及、蛇床子提取物制成，為治療婦科炎癥而正在進行研制的復(fù)方中藥新藥，其中積雪草清熱利濕、解毒消腫，白及收斂止血、消腫生肌，蛇床子燥濕祛風、殺蟲止癢，全方共行祛腐生肌，消腫止痛，殺蟲止癢的功效[5]。本研究通過使用大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌建立大鼠混合感染性陰道炎模型，用ELIAS法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8以及EGFR含量的變化，結(jié)果顯示葡甘露聚糖凝膠可明顯降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的含量、升高EGFR的含量，結(jié)合病理檢測結(jié)果，表明葡甘露聚糖凝膠在局部治療陰道炎后可明顯減輕炎癥反應(yīng)，具有良好的治療效果和臨床推廣價值。