李苓頊 王 敏 劉建勛 簡 潔 孫桂波▲

1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林 541199；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100094；3.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atherosclerotic heart disease，CHD）簡稱冠心病，是我國最常見的心血管疾病之一[1]。目前，盡管經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI）、外科搭橋等治療手段已取得一定進展，但仍存在藥物抵抗及術(shù)后胸悶、胸痛等臨床難題。中藥復(fù)方因其副作用小、患者依從性高等優(yōu)勢，受到廣泛關(guān)注[2-4]。

研究表明補陽還五湯通過抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗血小板聚集等作用治療冠心病[5-7]。目前，臨床或動物實驗多是通過比較分散的靶點來探討其治療冠心病的作用機制，很少從整體的角度闡釋補陽還五湯的作用機制，且其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機制等方面的研究也尚未完全闡明。故本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合多成分、多靶點探究補陽還五湯治療冠心病的作用機制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，以期獲得新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 復(fù)方靶點收集

利 用BATMAM-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）和TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/）檢索補陽還五湯的活性成分，其中地龍的活性成分通過國內(nèi)外文獻調(diào)研獲得[8]。

1.2 冠心病靶點收集

以“coronary heart disease”為檢索詞在OMIM（https://omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/）、DisGeNET（http://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索相應(yīng)的靶點[9]。

1.3 補陽還五湯與冠心病共同靶點交集

利 用Venny 2.1.0平 臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）制作成分靶點與冠心病靶點交集圖并獲得交集靶點[10]。

1.4 交集靶點互作

將交集靶點錄入STRING數(shù)據(jù)庫（http: //stringdb.org/），將作用參數(shù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，利用CytoHubba插件查找樞紐基因，構(gòu)建共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）[11]。

1.5 基因本體論（GO）及京都基因與基因組（KEGG）富集分析

將交集靶輸入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）獲得GO和KEGG數(shù)據(jù)，使用R軟件對GO和KEGG富集分析進行可視化。

1.6 中藥-成分-靶點-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將補陽還五湯的成分以及靶點和關(guān)鍵通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化處理。

1.7 分子對接

將“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值排名前三的活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點進行分子對接。其中，化合物和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分別在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org）獲取。運用Autodock Vina軟件進行分子對接，并用Pymol軟件對結(jié)果進行展示[12]。

2 結(jié)果

2.1 補陽還五湯活性成分靶點收集

通過數(shù)據(jù)庫活性成分并結(jié)合相關(guān)文獻檢索共獲取109個成分，得到434個作用靶點（表1）。

表1 “中藥-活性成分-靶點”信息

2.2 復(fù)方及疾病共靶點交集

將去重后的237個藥物靶點與706個冠心病靶點通過Venny平臺制作靶點交集圖，獲得交集靶點45個（圖1）。

圖1 補陽還五湯活性成分與冠心病共同靶點韋恩圖

2.3 靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建PPI靶點網(wǎng)絡(luò)（圖2），運用CytoHubba插件按Degree值大小篩選前8位關(guān)鍵靶點（表2），獲取關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。

圖2 共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 度值前8位的共同靶點

圖3 核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 靶點GO功能注釋及KEGG通路富集分析

GO分析中得到包括活性氧合成與代謝、脂多糖反應(yīng)（BP）52條；膜筏、膜微區(qū)（CC）12條；核受體活性、甾體激素受體活性（MF）24條，見圖4。

圖4 交集靶點GO富集分析

KEGG通路富集分析（圖5）得到69個條目，結(jié)果表明基因主要富集在流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）等信號通路。截取流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路作補充說明（圖6）。

圖5 交集靶點KEGG富集分析

圖6 流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路

2.5 中藥-活性成分-靶點-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape 3.7.1軟件對獲得的中藥、成分、靶點以及關(guān)鍵通路進行可視化處理（圖7），圖中包含7個中藥節(jié)點、57個活性成分節(jié)點、32個關(guān)鍵靶標節(jié)點以及14個關(guān)鍵通路節(jié)點，共110個節(jié)點。

圖7 “中藥-成分-靶點-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對接

將Degree值排名前3位的活性成分木犀草 素（lutcolin）、槲 皮 素（quercetin）和 山 柰 酚（kaempferol）與關(guān)鍵靶標PTGS2進行分子對接（圖8）。結(jié)果表明三種化合物與PTGS2的結(jié)合能均≤-7.0 kCal/mol（木犀草素=-8.4 kCal/mol；槲皮素=-7.9 kCal/mol；山柰酚=-7.7 kCal/mol），展現(xiàn)出良好的結(jié)合力，其中山柰酚數(shù)值最小，與PTGS2結(jié)合能最好。

圖8 化學(xué)成分與靶點的分子對接圖

3 討論

PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，IL-6、PTGS2和MMP9等為補陽還五湯治療冠心病的潛在作用靶點。IL-6常作為炎癥的生物標志物，是冠心病嚴重程度的重要預(yù)測因子[13]。PTGS2參與調(diào)控脂質(zhì)代謝和炎癥以及抗血栓形成[14]。MMP9可增加心臟自噬通量，從而改善心肌梗死[15]。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)AGE-RAGE、NF-κB、HIF-1等可能是冠心病的治療通路。AGE-RAGE信號通路激活會導(dǎo)致組織纖維化，引發(fā)動脈粥樣硬化的發(fā)展和進展[16]。NF-κB信號通路在各種炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用[17]。HIF-1信號通路是心臟代謝和血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，對心肌保護具有重要作用[18]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對接的方法探究補陽還五湯治療冠心病的作用機制，進一步驗證了中藥復(fù)方通過多靶點、多途徑來治療疾病的過程。由于本研究是基于網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)以及生物信息學(xué)所得出的結(jié)果，后續(xù)還需通過試驗研究進行驗證。希望本研究能為補陽還五湯治療冠心病提供新的治療思路。