高紅葉 陳永霞 張瑋潔 崔宏偉

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤分子診斷實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院科研部，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000

2020年CA-CANCER J CLIN指出，肺癌的估計(jì)發(fā)病率和病死率在所有癌癥中位居首位[1]。肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），分別約占13%和87%。肺鱗癌（LUSC）約占NSCLC的40%[2]。與肺腺癌相比，晚期LUSC臨床預(yù)后差，缺乏靶向藥物[3-5]。因此，全面地了解LUSC進(jìn)展的分子機(jī)制對(duì)于開發(fā)新的治療方法至關(guān)重要。

近年來，研究證明[6-7]腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）在腫瘤進(jìn)展和治療中起著重要作用。闡明TME在晚期LUSC中的生物學(xué)特性仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。既往文獻(xiàn)[8]表明FDCSP能夠影響腫瘤進(jìn)展，但是否與肺癌相關(guān)，尚不清楚。本研究通過生物信息學(xué)方法探討FDCSP在晚期LUSC中的作用，分析其作用機(jī)制，為探索晚期LUSC新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及觀察指標(biāo)

從TCGA數(shù) 據(jù) 庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載LUSC數(shù)據(jù)，下載時(shí)間為2022年4月。根據(jù)肺癌第8版TNM分期對(duì)患者重新分期，選取晚期（Ⅲ期及Ⅳ期）患者分析，流程如圖1。主要分析FDCSP表達(dá)與臨床特征（性別、年齡、種族、T分期、N分期、M分期、第8版TNM分期、位置、化療、化療效果）相關(guān)性。分析FDCSP對(duì)于總生存期（overall survival，OS）及無病生存期（disease free survival，DFS）的影響。探討FDCSP可能影響的生物學(xué)過程，免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性以及突變情況和與腫瘤異質(zhì)性關(guān)系。

1.2 方法

使用R3.6.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行下載。使用在線分析平臺(tái)Sangerbox（http://vip.sangerbox.com/）進(jìn)行生存分析Kaplan-Meier曲線、Log-rank檢驗(yàn)及腫瘤異質(zhì)性分析。使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)臨床特征與FDCSP表達(dá)關(guān)系進(jìn)行分析，對(duì)計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，對(duì)計(jì)量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)。使用R3.6.1中GSEA包進(jìn)行基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），使用ESTIMATES包進(jìn)行ESTIMATES分析，突變采用maftools包進(jìn)行分析。使用CIBERSORT算法進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FDCSP對(duì)于晚期LUSC患者預(yù)后影響。

下載TCGA中LUSC RNA-seq和臨床數(shù)據(jù)，按照第8版TNM分期整理，篩出晚期LUSC（Ⅲ和Ⅳ期）106例（圖1）。整理后刪除無生存期、無生存狀態(tài)等的患者。最終分別對(duì)103例和98例患者進(jìn)行OS和DFS分析（圖2A～B），取最佳截止值。結(jié)果顯示，F(xiàn)DCSP表達(dá)對(duì)于晚期鱗癌患者OS（P＜ 0.001，HR=0.42）和DFS（P＜ 0.001，HR=0.41）均具有顯著影響。

圖1 分析流程

圖2 對(duì)不同表達(dá)量FDCSP的晚期LUSC患者進(jìn)行OS（A）和DFS（B）分析

2.2 臨床特征關(guān)系

對(duì)進(jìn)行OS分析的103例患者FDCSP表達(dá)情況與臨床特征進(jìn)行分析（表1）。按照生存分析中OS最佳截止值，即兩組最佳截止中位值OS分別為14.73個(gè)月和44.75個(gè)月，對(duì)FDCSP進(jìn)行分組。FDCSP的表達(dá)與臨床特征并無顯著關(guān)系

2.3 GSEA富集分析

GSEA發(fā)現(xiàn)（圖3A～C），高表達(dá)組主要影響免疫相關(guān)通路，而低表達(dá)組主要集中在代謝相關(guān)通路。為了進(jìn)一步明確FDCSP的作用機(jī)制，對(duì)FDCSP于免疫方面相關(guān)影響進(jìn)行了分析。

圖3 GSEA結(jié)果

表1 FDCSP與臨床特征關(guān)系

2.4 與免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)分析

對(duì)103例患者進(jìn)行ESTIMATES分析，發(fā)現(xiàn)ESTIMATEScore（t=-2.829，P＜ 0.01）、ImmuneScore（t=-3.802，P＜ 0.001）在不同F(xiàn)DCSP表達(dá)組有顯著差異，而StromalScore（t=-1.457，P=0.418）未見明顯差異（圖4A）。提示FDCSP可能與腫瘤免疫反應(yīng)相關(guān)。因此，應(yīng)用CIBERSORT分析晚期LUSC患者免疫細(xì)胞浸潤情況（圖4B），并與FDCSP的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析（圖4C），發(fā)現(xiàn)FDCSP與巨噬細(xì)胞M2（P＜ 0.001）、調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Tregs）（P＜ 0.001）浸潤顯著相關(guān)，與巨噬細(xì)胞M0（P=0.09）、靜止記憶CD4T細(xì)胞（P=0.070）具有相關(guān)趨勢(shì)。分析浸潤免疫細(xì)胞對(duì)于預(yù)后影響（幼稚CD4T細(xì)胞、T細(xì)胞γδ、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤比例過低，無法進(jìn)行生存分析）發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞M1（P=0.005）、靜止肥大細(xì)胞（P=0.010）、記憶B細(xì)胞（P=0.030）、活化記憶T細(xì)胞（P=0.020）顯著影響患者預(yù)后，并且活化樹突狀細(xì)胞（P=0.060）、靜止NK細(xì)胞（P=0.070）、靜息的記憶CD4T細(xì)胞（P=0.070）、巨噬細(xì)胞M2（P=0.090）具有影響預(yù)后趨勢(shì)。

圖4 FDCSP與免疫浸潤細(xì)胞關(guān)系

2.5 與突變關(guān)系

對(duì)多種腫瘤中FDCSP的突變情況分析發(fā)現(xiàn)其突變頻率很低，如膠質(zhì)瘤（GBMLGG）、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）、結(jié)腸癌（COAD）、結(jié)直腸癌（COADREAD）、急性髓細(xì)胞樣白血?。↙AML）、浸潤性乳腺癌（BRCA）、胃和食管癌（STES）、胃癌（STAD）、子宮內(nèi)膜癌（UCEC）、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）、LUSC、胰腺癌（PAAD）、膀胱尿路上皮癌（BLCA），可說明FDCSP基因的保守性。但在不同F(xiàn)DCSP表達(dá)組中發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)組突變頻率更高，這可能與其更差的預(yù)后相關(guān)（圖5）。

圖5 FDCSP與突變關(guān)系

2.6 FDCSP對(duì)晚期肺鱗癌異質(zhì)性的影響

為了進(jìn)一步分析FDCSP對(duì)于晚期LUSC異質(zhì)性的影響，對(duì)目前評(píng)估腫瘤異質(zhì)性（tumour heterogeneity）的指標(biāo)[9-12][腫瘤突變負(fù)荷（t=-1.283，P=0.203）；腫瘤特異性突變位點(diǎn)的MAF mutant-allele fractions值的分布偏差（t=-1.060，P=0.292）；微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（t=-1.503，P=0.136）；腫 瘤 新 抗 原（t=-0.573，P=0.568）；腫瘤純度（t=-2.272，P=0.025）；同源重組缺陷評(píng)分（t=0.442，P=0.695）；基因組雜合缺失（t=-0.573，P=0.593）]進(jìn)行分析（圖6），結(jié)果提示FDCSP表達(dá)顯著影響晚期LUSC腫瘤純度。

圖6 FDCSP對(duì)于晚期LUSC患者異質(zhì)性影響

3 討論

LUSC約占NSCLC的40%[2]。晚期LUSC預(yù)后差，缺乏靶向藥物。因此，了解LUSC進(jìn)展的分子機(jī)制對(duì)于開發(fā)新的治療方法至關(guān)重要。

FDCSP主要由B細(xì)胞激活FDC表達(dá)[13]，可以調(diào)節(jié)B細(xì)胞免疫反應(yīng)[13-14]，并且可能在自身免疫性疾病中起作用[15]。FDCSP可通過促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲來促進(jìn)卵巢癌轉(zhuǎn)移[8]，但是否與肺癌相關(guān)尚不清楚。

TME在疾病發(fā)生中起重要作用[6-7]。TME是指局部腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境，又稱腫瘤間質(zhì)。TME不僅在腫瘤的發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，而且顯著影響治療效果[16-18]。TME，尤其是免疫組分，對(duì)腫瘤的發(fā)展起著重要作用。有研究已證實(shí)，將TME從腫瘤促進(jìn)型轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤抑制型能夠顯著改善腫瘤治療效果[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)FDCSP與預(yù)后顯著相關(guān)。同時(shí)，高表達(dá)FDCSP在免疫相關(guān)過程富集。巨噬細(xì)胞M2、調(diào)節(jié)T細(xì)胞與FDCSP表達(dá)密切相關(guān)。以上結(jié)果提示FDCSP可能通過調(diào)控TME中免疫細(xì)胞浸潤發(fā)揮作用。另外FDCSP是一種高度保守基因，其在大部分腫瘤中突變頻率均很低。腫瘤異質(zhì)性是惡性腫瘤的重要特征，其在進(jìn)展和耐藥性方面發(fā)揮重要作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)FDCSP低表達(dá)組基因整體突變頻率明顯增高，且FDCSP顯著影響晚期LUSC腫瘤純度。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)FDCSP表達(dá)與晚期LUSC患者預(yù)后呈正相關(guān)，其作用機(jī)制可能與TME中免疫細(xì)胞的浸潤相關(guān)，F(xiàn)DCSP可以作為一個(gè)預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。以上均為生物信息學(xué)分析結(jié)果，進(jìn)一步研究應(yīng)側(cè)重于通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析其準(zhǔn)確性。