劉 超，岳陽(yáng)陽(yáng)，張孟釗，劉 爽，李小兵，李 延

腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)是炎癥、氧化應(yīng)激等因素所致腹主動(dòng)脈不可逆擴(kuò)張，隨著瘤體直徑增大，破裂風(fēng)險(xiǎn)增加，瘤體一旦破裂，病死率可達(dá)80%以上[1]。目前，臨床治療AAA以手術(shù)或介入治療為主，尚無(wú)藥物治療方法，深入了解其發(fā)病機(jī)制，尋找有效治療靶點(diǎn)，可為臨床治療提供新的思路和方向[2]。中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)是AAA的主要病理機(jī)制之一，研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子在腹主動(dòng)脈壁炎性細(xì)胞黏附聚集過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。CXC趨化因子受體2(CXCR2)是CXC趨化因子受體家族成員，在炎性細(xì)胞中廣泛表達(dá)，介導(dǎo)疾病的炎癥反應(yīng)過(guò)程，故推測(cè)其可能參與AAA的發(fā)生與發(fā)展，但目前CXCR2與AAA關(guān)系的相關(guān)研究較少[4]。除此之外，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)所介導(dǎo)的膠原蛋白與彈力纖維降解也是AAA的重要病理機(jī)制之一[5]。本研究旨在分析AAA組織CXCR2表達(dá)及其與已知炎性細(xì)胞因子基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的關(guān)系，以深入了解AAA的發(fā)病機(jī)制，為臨床診治提供新的思路和方向，詳述如下。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2019年7月—2022年7月我院80例AAA作為觀察組。①納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)影像學(xué)檢查及手術(shù)病理證實(shí)為AAA；患者知情同意并自愿配合。②排除標(biāo)準(zhǔn)：存在自身免疫性疾病、感染性疾病者；近期應(yīng)用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素類藥物者；臨床資料不完整者。另選取同時(shí)期行腹動(dòng)脈-股動(dòng)脈移植術(shù)者40例作為對(duì)照組。觀察組男44例，女36例；年齡31～68(56.27±8.45)歲。對(duì)照組男24例，女16例；年齡29～66(55.76±6.80)歲。2組性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1樣本采集：留取觀察組術(shù)中AAA前壁組織及對(duì)照組腹前動(dòng)脈血管吻合處正常動(dòng)脈壁組織，甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片，-80 ℃凍存待檢。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)[6]：二甲苯、梯度酒精脫蠟脫水，PBS緩沖液沖洗，加3%過(guò)氧化氫甲醇液、3%山羊血清封閉液，依次加CXCR2單克隆抗體、MMP-9單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜。PBS緩沖液沖洗，加二抗，37 ℃孵育50 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染。400倍鏡下，隨機(jī)選擇5個(gè)視野觀察，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞的占比。陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞占比<25%計(jì)1分，25%≤陽(yáng)性細(xì)胞占比≤50%計(jì)2分，50%<陽(yáng)性細(xì)胞占比<75%計(jì)3分，陽(yáng)性細(xì)胞占比≥75%計(jì)4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色計(jì)0分，輕度染色計(jì)1分，中度染色計(jì)2分，重度染色計(jì)3分。總分=陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分，總分>3分為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.2.3蛋白免疫印跡法：組織樣本加入蛋白提取液制成勻漿，4 ℃過(guò)夜，15 000 r/min離心50 min分離上清液，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Thermo)，測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳，各泳道加入30 μg蛋白上清液，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加5%脫脂牛奶，封閉放置2 h。分別加入CXCR2單克隆抗體、MMP-9單克隆抗體，4 ℃封閉放置過(guò)夜；PBS緩沖液沖洗，加入稀釋至1∶5000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的馬抗鼠IgG二抗(美國(guó)Sigma)，37 ℃孵育2 h。PBS緩沖液沖洗，加入ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑(上海杰美基因醫(yī)藥科技)，分析目的條帶光密度值。

1.2.4RT-PCR：采用TRIzol RNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)提取總RNA，采用紫外分光光度法測(cè)定總RNA濃度。取1 μg總RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄模板1 μl，逆轉(zhuǎn)錄緩沖液3 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，加雙蒸水至20 μl總反應(yīng)體系，37 ℃反應(yīng)50 min，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。PCR反應(yīng)體系：cDNA 2.5 μl，PCR試劑混合液12.5 μl，DEPC 8 μl，上下游引物各1 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)40次，72 ℃延伸5 min。引物序列：CXCR2上游：5'-CAGCGACCCAGTCAGGATTTA-3'，下游：5'-ACCAGCATCACGAGGGAGTTT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度251 bp；MMP-9上游：5'-GCTGGTGTTATGTGAAGTTTTCAAG-3'，下游：5'-CCGTTTACAGGTGTGCCTCAAATGG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度317 bp；內(nèi)參引物序列上游：5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'，下游：5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度318 bp，均由北京三博遠(yuǎn)志公司提供。瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增片段，分析基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3觀察指標(biāo) 比較2組CXCR2、MMP-9蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)水平。比較不同臨床病理特征AAA患者CXCR2蛋白表達(dá)情況，并分析CXCR2與MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1CXCR2、MMP-9蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，觀察組CXCR2、MMP-9蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均高于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 2組不同組織CXCR2、MMP-9蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較[例(%)]

2.2CXCR2、MMP-9蛋白表達(dá)量比較 蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，觀察組CXCR2、MMP-9蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 2組不同組織CXCR2、MMP-9蛋白表達(dá)量比較

2.3CXCR2、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 RT-PCR結(jié)果顯示，觀察組CXCR2、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 2組不同組織CXCR2、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.4不同臨床病理特征AAA患者CXCR2蛋白表達(dá)情況比較 瘤體直徑≥5 cm、有心腦血管意外史AAA患者CXCR2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別高于瘤體直徑<5 cm、無(wú)心腦血管意外史患者(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同臨床病理特征AAA患者CXCR2蛋白表達(dá)情況比較[例(%)]

2.5CXCR2與MMP-9蛋白表達(dá)量相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，CXCR2與MMP-9蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.547，P<0.001)。

3 討論

AAA發(fā)生是一個(gè)慢性過(guò)程，其中一個(gè)重要環(huán)節(jié)是單核細(xì)胞募集至腹主動(dòng)脈內(nèi)壁，并進(jìn)入外膜，引發(fā)炎癥反應(yīng)，在炎性細(xì)胞的趨化過(guò)程中，趨化因子發(fā)揮重要作用[7]。CXCR2是G蛋白耦聯(lián)受體超家族成員，在單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面表達(dá)，刺激炎性細(xì)胞的趨化[8]。既往研究證實(shí)，CXCR2與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，而動(dòng)脈粥樣硬化又是AAA的已知危險(xiǎn)因素之一，故推測(cè)CXCR2可能參與AAA的發(fā)生與發(fā)展[9]。本研究結(jié)果顯示，AAA組織CXCR2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于正常動(dòng)脈壁組織，AAA組織CXCR2蛋白表達(dá)量高于正常動(dòng)脈壁組織，AAA組織CXCR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于正常動(dòng)脈壁組織，這一結(jié)果與既往研究相符[10]，證實(shí)CXCR2在AAA組織中高表達(dá)，提示其可能參與AAA的發(fā)生。

針對(duì)AAA患者臨床病理特征的分析顯示，瘤體直徑≥5 cm和有心腦血管意外史AAA患者CXCR2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別高于瘤體直徑<5 cm和無(wú)心腦血管意外史患者，表明CXCR2蛋白表達(dá)升高提示患者處于病情更嚴(yán)重、風(fēng)險(xiǎn)更高的狀態(tài)。AAA的組織學(xué)改變以腹主動(dòng)脈壁膠原降解、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管新生等為主[11]。腹主動(dòng)脈細(xì)胞外基質(zhì)以膠原、彈力蛋白為主要成分，二者的合成與降解在正常生理狀態(tài)下可保持動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而維持腹主動(dòng)脈正常的結(jié)構(gòu)功能[12]。而病理狀態(tài)下，炎性細(xì)胞分泌大量MMPs，使膠原酶激活，膠原蛋白分解加速，導(dǎo)致腹主動(dòng)脈持續(xù)擴(kuò)張[13]。MMPs是以鈣離子、鋅離子為輔助因子的蛋白水解酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白成分，在組織重構(gòu)、炎癥反應(yīng)及心血管疾病、惡性腫瘤中起關(guān)鍵作用。MMP-9可促進(jìn)彈力蛋白降解，降解產(chǎn)物可趨化白細(xì)胞，進(jìn)一步導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，促成AAA的發(fā)生與發(fā)展。有研究證實(shí)，AAA血管壁中MMP-9表達(dá)上調(diào)，參與慢性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而介導(dǎo)血管重塑[14]。本研究Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CXCR2與MMP-9蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，表明CXCR2表達(dá)上調(diào)可能通過(guò)靶向調(diào)控MMP-9過(guò)表達(dá)，進(jìn)而參與AAA的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，CXCR2、MMP-9在AAA患者主動(dòng)脈瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且CXCR2與MMP-9蛋白表達(dá)量具有正相關(guān)性，CXCR2可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)，參與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與慢性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)AAA的發(fā)生與病情進(jìn)展。