宋 波，楊 曉，劉高峰，鄭胤建，卞中華，何莉梅，練華山，荊贊革，李清明*，楊其長

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所，四川 成都 611130；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院農(nóng)業(yè)園藝學(xué)院，四川 成都 611130；3.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650217）

“中絲2號”絲瓜是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所培育的長棒型普通絲瓜雜交新品種，具有早熟性好，果實順直且翠綠，果肉不易褐變等優(yōu)良特性。隨著新品種的推廣和示范，市場反響良好。絲瓜種子質(zhì)量的好壞取決于雜交制種純度，在制種過程中主要存在母本自交結(jié)實造成的生物學(xué)混雜問題，進(jìn)而影響絲瓜雜交種的純度。目前，絲瓜種子純度主要采用常規(guī)田間純度鑒定，但這種方法存在鑒定周期長，鑒定效率較低等問題，故篩選建立高效鑒定絲瓜雜交種純度的分子標(biāo)記，顯得尤為重要。

SSR（Simple Sequence Repeats）分子標(biāo)記檢測具有可鑒別出雜合子和純合子，特異擴增產(chǎn)物數(shù)量豐富，檢測時間短，價格便宜，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，檢測樣品多，在植物的各個生長期均可檢測以及品種純度檢測效率高等優(yōu)點[1-2]。在瓜類蔬菜種子純度鑒定研究中，SSR分子標(biāo)記運用比較廣泛，目前在黃瓜[3]、西瓜[4-5]等作物中已取得較好的鑒定效果，鑒定結(jié)果與大田種子純度檢測結(jié)果吻合率達(dá)96%～100%。近年來，絲瓜種子純度鑒定研究也取得了一些進(jìn)展，朱海生等[6]研究發(fā)現(xiàn)，引物SGSSR4在“絲盛2號”雜交種中擴增出含有父、母本遺傳信息的特異互補帶型，利用該引物進(jìn)行雜交種子純度鑒定結(jié)果與大田種植鑒定結(jié)果一致；陳曦等[7]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對絲瓜雜交種“農(nóng)福絲瓜801”及其親本的DNA指紋進(jìn)行分析，篩選出了特異性ISSR引物3個（ISSR-820、ISSR-886和ISSR-891），且能夠運用于“農(nóng)福絲瓜801”的純度鑒定。本研究以“中絲2號”絲瓜的父母本及其雜種F1代為材料，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行雜交種純度的鑒定，以期建立一套室內(nèi)快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟的絲瓜種子純度鑒定方法，為加速品種的推廣奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年1—6月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所新津試驗基地進(jìn)行。供試材料為雜交種（F1）“中絲2號”及其母本（P1）、父本（P2），共3份材料，于2022年1月15日播種，2月20日定植于大棚中。

DNA提取試劑盒，購于上海浦迪生物公司。PCR擴增試劑，購于南京擎科生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取與檢測

在絲瓜3葉期，取F1、P1、P2幼苗第2片真葉提取DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測絲瓜DNA純度與完整性。具體檢測方法：取1 g瓊脂糖粉，加入100 mL的TAE混合后放入微波爐中加熱3 min，然后加入核酸染料6 μL搖勻，倒入模具中凝固1 h；凝固后上樣品5 μL，電泳20 min，電泳結(jié)束后放入凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.2.2 SSR引物篩選

根據(jù)劉軍等[8]、朱海生等[9]發(fā)表的引物序列進(jìn)行篩選，由南京一道生物科技有限公司負(fù)責(zé)引物合成，引物序列見表1。SSR反應(yīng)體系及參數(shù)：反應(yīng)體系10 μL，上下游引物（濃度10 mmol/μL）各0.5 μL，模板DNA約40 ng，2×TsingKe Mix 4 μL，用ddH2O補足體積。PCR擴增反應(yīng)程序為：96 ℃預(yù)變性2 min；96 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。擴增結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物采用5%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離。5%聚丙烯酰胺凝膠配制如下：聚丙烯酰胺母液（29∶1），10.8 mL；5×TBE，8.0 mL；10% APS，500 μL；TEMED，20 μL；ddH2O，21.2 mL。配制后倒入玻璃模具中凝固2 h后，放入電泳槽，上樣量3 μL，電泳1 h，電泳后取膠進(jìn)行染色。染色方法：加入乙醇25 mL、冰乙酸1.25 mL、ddH2O 223.75 mL，固定10 min，然后用蒸餾水沖洗2次；再加入AgNO30.5 g、ddH2O 250 mL，避光銀染15 min后，用蒸餾水沖洗2次；最后加入NaOH 3.75 g、CH2O 2.64 mL、ddH2O 244.53 mL，顯色10 min；染色結(jié)束后小心取出，放入X射線膠片觀察燈上進(jìn)行拍照，仔細(xì)觀察膠片，篩選出在雙親中具有差異條帶的引物編號。

表1 24對SSR標(biāo)記的引物序列

1.2.3 擴大雙親及F1中的引物驗證

為了進(jìn)一步驗證篩選到的多態(tài)性引物，故選取6株父本、6株母本以及4株F1（“中絲2號”），先將引物ZS-SSR24在絲瓜親本間進(jìn)行了雙親擴大驗證，再驗證F1代的帶型，分析F1是否同時繼承雙親的差異條帶。PCR擴增與電泳分析方法參照1.2.2。

1.2.4 F1群體的SSR純度鑒定

選擇“中絲2號”單株46個，用ZS-SSR24引物進(jìn)行SSR驗證，若同時擴增出雙親的差異條帶，則確定為F1，若只具有父本或母本單一的帶型，則確定為混入F1里的父本或母本種子。F1純度計算方法：F1純度＝具有互補帶型的單株數(shù)/總株數(shù)×100%。

1.2.5 田間純度鑒定

對1.2.4中所述“中絲2號”46個單株進(jìn)行田間F1驗證，于5月下旬果實達(dá)到商品成熟后，根據(jù)絲瓜雜交種的SSR分子純度鑒定結(jié)果，對照取樣編號，逐一對單株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀察記載，調(diào)查性狀包括葉色、葉形和果實性狀等，對疑似雜株進(jìn)行仔細(xì)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取與檢測

由圖1可知，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的絲瓜DNA，結(jié)果顯示帶型一致，無降解現(xiàn)象，無蛋白質(zhì)和RNA等雜質(zhì)污染。濃度檢測結(jié)果顯示，樣品DNA濃度介于20～100 ng/μL，能滿足后續(xù)SSR反應(yīng)的需求。

圖1 雙親和F1的DNA電泳檢測結(jié)果

2.2 引物的篩選

由圖2中24對SSR引物在“中絲2號”雙親中的擴增結(jié)果可知，除4條引物（SSR3、SSR5、SSR13和SSR16）不能擴增出條帶外，其余20條引物均能獲得較穩(wěn)定的擴增圖譜；但在20條引物中，僅有1對引物（ZS-SSR24）能在“中絲2號”父母本之間擴增獲得差異條帶。

圖2 雙親的SSR多態(tài)性分析

2.3 擴大雙親及F1中驗證引物準(zhǔn)確性

2.3.1 擴大雙親驗證引物準(zhǔn)確性

從圖3中可知，在雙親中均擴增出了特異性條帶，說明篩選到的引物在雙親中確實存在多態(tài)性，分別在母本和父本中擴增出220 bp和250 bp大小的差異條帶（圖3a）。

2.3.2 雙親和F1驗證引物的準(zhǔn)確性

從理論上講，凡是同時具有雙親特異性條帶的就應(yīng)該是真雜種，反之，就可能是F1中混入了父本或者母本。分別選取雙親和4個F1，利用引物ZS-SSR24進(jìn)行擴增，在F1中，ZS-SSR24引物在父母本之間分別擴增獲得250 bp和220 bp的差異條帶，全部的F1均繼承雙親的特異性條帶，說明ZS-SSR24引物是1個共顯性標(biāo)記（圖3b）。

圖3 ZS-SSR24引物在雙親及F1中的擴增結(jié)果

2.4 F1群體SSR純度驗證

ZS-SSR24引物擴增結(jié)果表明，在46個F1群體中，除了第15、24、29和43泳道僅擴增出母本的特異性條帶，其他F1泳道均擴增出雙親的條帶，故確定上述4個單株是混入F1中的母本種子，純度鑒定結(jié)果為91.3%（圖4）。

圖4 ZS-SSR24引物在F1群體中的驗證結(jié)果

2.5 F1田間純度鑒定

田間農(nóng)藝性狀鑒定結(jié)果表明，在46份“中絲2號”植株樣本中，2.4中確定的4株均表現(xiàn)出了母本典型性狀（果皮淺綠色、果實較長、葉片大等性狀），可以明顯與父本（短棒型）和“中絲2號”（果實順直，果皮翠綠）區(qū)分開來。經(jīng)計算，這批樣本的純度為91.3%，田間鑒定結(jié)果與SSR分子鑒定結(jié)果完全吻合。

3 結(jié)論與討論

由于絲瓜種瓜成熟時間長，在新疆或甘肅等主要絲瓜制種地區(qū)生產(chǎn)的雜交種直到10月初才能陸續(xù)收獲。這時四川地區(qū)的溫度趨低，通過當(dāng)?shù)靥镩g栽培進(jìn)行純度鑒定已不可行，而未經(jīng)鑒定的雜交種一旦進(jìn)入市場，會帶來極大的風(fēng)險。但通過苗期取樣進(jìn)行SSR分子標(biāo)記純度鑒定，則大大加速了純度鑒定的進(jìn)程，保障種子質(zhì)量達(dá)標(biāo)的新種子能夠順利進(jìn)入市場銷售。朱海生等[6]研究表明，利用SSR分子標(biāo)記能夠鑒定絲瓜的純度，但采用的群體相對較小，故需要擴大群體進(jìn)行驗證，研究結(jié)果才更準(zhǔn)確。本研究采用相對較大的F1群體進(jìn)行驗證，結(jié)果表明，ZS-SSR24引物在“中絲2號”的擴增結(jié)果表現(xiàn)為1個共顯性標(biāo)記，能夠有效鑒定出混在其中的父本或者母本種子，分子標(biāo)記結(jié)果與田間觀察結(jié)果完全吻合，樣本純度均為91.3%，說明ZS-SSR24引物能夠高效鑒定“中絲2號”絲瓜品種的純度。

在絲瓜制種過程中，種子不純的主要原因是母本的雌花接受了自身的花粉，從而得到自交果實，導(dǎo)致母本自交種子與雜交種混在一起，產(chǎn)生假雜種；本研究鑒定出的4個雜株均來自母本自交的種子，說明只要能有效區(qū)分F1和母本的SSR標(biāo)記，就能夠運用于絲瓜雜交種純度的鑒定。