張海燕, 李艷美, 華 鵬

(1.烏魯木齊海關技術中心 (庫爾勒)，新疆 庫爾勒 841000；2.中華人民共和國庫爾勒海關，新疆 庫爾勒 841000；3.伊寧海關技術中心，新疆 伊寧 835000)

我國新疆巴州地區(qū)以其獨特的地理氣候環(huán)境培育了一大批品質優(yōu)良的水果，如若羌紅棗、輪臺白杏、庫爾勒香梨等已成為國家地理標志性產品。農藥在促進作物豐產、減少病蟲害的同時，其不合理使用導致的污染已影響到農產品質量安全。我國雖然規(guī)定了上述水果中多種農藥的最大殘留限量 (MRL)[1]，但仍有部分農藥殘留尚無MRL 值，且在已規(guī)定 MRL 值的農藥中用于干棗的數量較少，針對其進行多種農藥殘留量的分析確證方法也不多，如我國標準 GB 2763—2021《食品中農藥最大殘留限量》規(guī)定了干棗中 46項、杏中 148 項、梨中 125 項以及葡萄中 216 項的MRL 值從 0.01～5 mg/kg 不等[1]。歐盟標準規(guī)定了上述果品中多數農藥殘留限量為 0.01 mg/kg[2]。

目前關于農藥殘留樣品前處理方法主要有QuEChERS 法[3-4]、固相微萃取法 (SPME)[5]、凝膠滲透色譜法 (GPC)[6]、液液萃取法 (LLE)[7]、固相萃取法 (SPE)[8]、加速溶劑萃取法 (ASE)[9]等，其中 QuEChERS 方法使用較為廣泛。檢測方法主要有氣相色譜 (GC) 法[10]、氣相色譜-質譜 (GC-MS)法[11]、氣相色譜-串聯(lián)質譜 (GC-MS/MS) 法[12]、液相色譜-串聯(lián)質譜 (LC-MS/MS) 法[13]、飛行時間-質譜 (TOF-MS) 法[14-15]、軌道阱質譜 (Obitrap-MS)法[16]、高效液相色譜 (HPLC) 法[17]等。其中 ，TOF-MS 法和 Obitrap-MS 法因設備價格昂貴而未普及，而GC 法和 HPLC 法因只能測定特定類型的化合物而限制了其廣范使用。相比 GC-MS 法，GC-MS/MS 由于使用二級質譜定性，具有更強的檢測靈敏度和選擇性，抗干擾能力更強。

本研究結合我國農藥殘留限量國家標準，建立了紅棗(干)、杏、葡萄和香梨 4 種果品中 99 種農藥殘留量測定的GC-MS/MS 方法，涉及12 種氨基甲酸酯類、34 種有機磷類、16 種有機氯類、10 種擬除蟲菊酯類和7 種三唑類及其他化合物。其中，包含 GB 2763—2021 中既未指定檢測方法、又無殘留限量標準(或只有臨時限量標準) 的6 種農藥 (速滅威、殺線威、甲硫威、殘殺威、特丁硫磷和氟菌唑)，指定 HPLC 或LC-MS/MS 檢測方法的 6 種農藥 (霜霉威、滅多威、敵百蟲、烯效唑、啶蟲脒和烯酰嗎啉)，以及 GB 23200.113—2018《食品安全國家標準 植物源性食品中 208 種農藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質譜聯(lián)用法》[18]中未包含的除上述農藥外的其他 12 種農藥(甲萘威、氟樂靈、3-羥基克百威、氟蟲腈、稻豐散、苯線磷、蟲螨腈、炔螨特、螺螨酯、吡唑醚菌酯、噻嗪酮及百菌清)。對市場采購的 89 份樣品中的農藥殘留量進行了分析。相比傳統(tǒng)方法，本研究快速簡便，避免了乙腈對色譜系統(tǒng)的傷害，使用成本低。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-串聯(lián)質譜儀 (GC trace 1310 TSQ 8000 EVO 型，配 Tracefinder 3.3 軟件，美國Thermo-Fisher 公司)；高速離心機 (CF16 RXII 型，日本HITACHI 公司)；電子天平 (SB 3200 型，瑞士METTLER TOLEDO 公司)；渦旋儀 (MS3 型，德國 IKA 公司)；水浴氮吹儀 (N-EVAP 112 型，美國 Organomation 公司)；超聲波清洗器 (SB 5200型，中國上海必能信超聲有限公司)；微孔濾膜(尼龍，0.22 μm，美國安捷倫公司)。

99 種農藥標準品(1000 mg/L，北京曼哈格公司)見表1。正己烷、丙酮和乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific 公司)。凈化劑：N-丙基乙二胺(PSA，粒徑40～63 μm )、氨基凈化劑 (NH2，粒徑40～63 μm)、十八烷基鍵合硅膠 (C18，粒徑 40～63 μm)、石墨化碳黑 (GCB，粒徑 38 μm) 和Carb/NH2固相萃取柱(500 mg/6 mL)，均為北京振祥公司，氯化鈉(分析純，天津市光復科技發(fā)展有限公司)，試驗用水 Milli-Q 超純水。

續(xù)表1Table 1 (Continued)

選擇新疆巴州地區(qū)4 種代表性水果基質紅棗(干)、杏、葡萄和香梨，它們多數為弱酸性，分別代表干果類、核果類、漿果類和仁果類水果，樣品均購自當地超市和農貿市場。

1.2 分析方法

1.2.1 儀器檢測條件

色譜條件：TG-5 MS 石英毛細管色譜柱(30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：70 °C 保持 1 min，以20 °C/min 升至 210 °C，保持 1 min；以 10 °C/min 升至 280 °C，保持 3 min；以 20 °C/min升至 300 °C，保持 2 min；載氣為氦氣，流速 1.0 mL/min，恒流模式；進樣口溫度 260 °C；進樣量1 μL；不分流進樣。

質譜條件：電子轟擊電離源 (EI )，電子能量70 eV；離子源溫度 280 °C；傳輸線溫度280 °C；溶劑延遲時間 4.0 min；多反應監(jiān)測 (MRM ) 模式。碰撞氣為氬氣 (純度≥ 99.999% )。

1.2.2 樣品前處理 準確稱取 5 g (精確至 ± 0.01 g)樣品，加入10 mL 乙腈 (干紅棗樣品提前加入10 mL水)，渦旋混勻后超聲 20 min；加入 5.0 g 氯化鈉，于 11 000 r/min 下離心 5 min；取上清液 2 mL，加入預先裝有 25 mg PSA (干紅棗、香梨均為 50 mg)、10 mg C18(干紅棗 25 mg )、0 mg GCB (干紅棗5 mg) 凈化劑的離心管，于 4000 r/min 下離心5 min；上清液于 40 °C 水浴氮吹近干，用 1 mL 丙酮復溶，過 0.22 μm 尼龍微孔濾膜，待 GC-MS/MS檢測分析。

1.2.3 標準溶液配制 用丙酮稀釋標準品溶液，配制成 100 mg/L 的單標儲備液；再用丙酮稀釋單標儲備液，配制成各農藥組分質量濃度均為 5 mg/L的混合標準中間溶液；根據測定需求，以丙酮逐級稀釋成 2 μg/mL 混合標準工作溶液，-18 °C 保存。按 1.2.2 節(jié)方法提取不含目標化合物的空白樣品，根據需要配制成 0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2 和0.5 mg/L 系列質量濃度的基質匹配標準工作溶液，現配現用。按 1.2.1 節(jié)方法和表1 所列條件測定，以質量濃度 (x) 為橫坐標、目標化合物定量離子的峰面積為縱坐標 (y)繪制標準曲線，得到 99 種農藥的線性方程和相關系數。

1.2.4 基質效應 基質效應與目標化合物的化學性質、樣品前處理方式、基質類型密切相關，含有羧基、氨基、酰胺基、羥基等官能團的化合物表現為更強的基質增強或抑制效應[19]。常采用 3種方法降低基質效應對化合物定量的影響：加入合適的分析保護劑； 采用適當的內標；使用基質匹配校準曲線定量。因分析保護劑并不能適用所有基質，為所有目標物找到各自的內標成本又較高，因此本試驗采用基質匹配外標法。通過Me/% = [(km-ks)/ks] × 100 評價基質效應大小(km為目標物在空白基質中校準曲線的斜率，ks為目標物在溶劑中校準曲線的斜率)。當Me＜ 0，體現為基質抑制效應，Me＞ 0 體現為基質增強效應；∣Me∣＜ 20% 時為弱基質效應，當 20% ≤∣Me∣≤ 50% 時為中等基質效應，當∣Me∣ ＞ 50%時為強基質效應。

2 結果與討論

2.1 儀器分析方法建立

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化 對比了兩種升溫程序時，2 μg/mL 混合標準工作溶液的色譜峰分離情況：① 70 °C 保持 1 min，以 40 °C/min 的速率升溫至 250 °C，以 10 °C/min 的速率升溫至 280 °C，保持5 min，再以 20 °C/min 的速率升溫至300 °C，保持 1 min；② 70 °C 保持 1 min，以20 °C/min 的速率升溫至 210 °C，保持 1 min，以10 °C/min 的速率升溫至 280 °C，保持 3 min，以20 °C/min 的速率升溫至 300 °C ，保持 2 min。結果發(fā)現：使用升溫程序①雖然可以縮短分析時間，但在 10～15 min 內，多數化合物出峰較為集中，應對復雜基質時，會降低色譜柱的分離度，雖然能夠通過各化合物的特征離子加以區(qū)分，但增加了后期方法設置選擇離子的難度。②中將升溫速率由 40 °C/min 降為 20 °C/min，同時延長最后一階升溫程序的保持時間，則可使沸點較高的化合物盡量流出，因此使用升溫程序②。

2.1.2 質譜參數的優(yōu)化 離子源溫度會影響離子化效率，比較了離子源溫度 220 °C 和280 °C 的出峰情況。結果發(fā)現：離子源溫度由220 °C 升高到280 °C 時，化合物的出峰個數和響應值均有所提高，同時為防止離子源受到污染，降低離子源維護頻率，離子源溫度設定為280 °C。

“起來，起來，快起來，狗日的，沒被鬼子炸死，也被你們這幫兔崽子壓死！”趙錫田翻了身，事發(fā)突然，他被壓在最下面啃了一嘴泥，那頂呢制將帽也不知滾到哪去了。

傳輸線是經色譜柱分離后的化合物進入離子源的通道，可為離子源提供可供電離的氣化態(tài)分子，比較了傳輸線溫度為260 °C 和280 °C 的出峰情況。結果表明：二者差別不大，為防止這些氣化態(tài)分子在到達離子源前產生冷凝，因此傳輸線溫度設為280 °C。

合適的特征離子可以避開背景干擾、降低檢出限，提高檢測靈敏度。通過 NIST 質譜數據庫檢索目標化合物的特征離子峰，利用多反應監(jiān)測模式 (MRM) 獲取各化合物的碰撞能和保留時間，選擇離子豐度強、質荷比大的 3 個特征離子作為母離子，采用 MRM 通過一定的碰撞能將其打碎，進行產物離子掃描，使其裂解成具有一定質荷比的產物離子，選擇峰型對稱，特征性強、響應值高的3 個離子作為子離子。優(yōu)化后 99 種農藥全掃描總離子流圖見圖1，質譜分析參數見表1。

圖1 99 種農藥在 MRM 模式下的總離子流圖Fig.1 The total ion chromatogram in MRM mode of the 99 pesticides

2.2 樣品前處理條件優(yōu)化

2.2.1 提取條件 歐盟15662 方法[20]和美國AOAC 2007.01 方法[21]分別以乙腈和乙腈-乙酸作為提取劑，本試驗以干紅棗基質為例，比較了乙腈和乙腈 + 0.1% 乙酸作為提取溶劑時目標農藥的回收率。結果表明：在100 μg/kg 添加水平下，以乙腈和乙腈 + 0.1% 乙酸做提取溶劑時，農藥的平均回收率分別為115%、124%，使用乙腈做提取溶劑滿足農藥殘留分析回收率在70%～120%的要求[22]，因此選擇乙腈作為提取試劑。圖2 顯示了分別采用上述兩種溶劑提取時，農藥的回收率情況。

圖2 兩種提取溶劑對農藥回收率的影響 (re：回收率)Fig.2 Effect of 2 extraction solvents on recovery of 99 pesticides (re means recovery)

2.2.2 鹽析劑選擇 為增加鹽析效應和加速水相與有機相的分離，考察了2 mL 提取液中分別使用2 g 無水硫酸鎂 + 0.5 g 氯化鈉和5 g 氯化鈉對回收率影響。結果表明：在100 μg/kg 添加水平下，同時使用無水硫酸鎂 + 氯化鈉的平均回收率低于單獨使用氯化鈉時的回收率，且無水硫酸鎂使用前需高溫烘烤，成本較高，因此最終采用氯化鈉作為鹽析劑。

2.2.3 凈化劑選擇 以干紅棗基質為例，采用單因素試驗，在 100 μg/kg 添加水平下，考察了 2 mL提取液中不同凈化劑對農藥回收率的影響。先分別優(yōu)化 NH2和 PSA 用量，再將C18/GCB 與之組合，考察混合后凈化效果。

比較了 NH2凈化劑用量 (25、50、75、100、150 和200 mg) 與 PSA 用量 (25、50、75、100、150 和200 mg) 對回收率的影響。 結果發(fā)現：使用NH2凈化劑時，回收率在 70%～120%的農藥比例分別為 28%、32%、31%、79%、62%和57%，即 NH2凈化劑用量在 100 mg 時，回收率在 70%～120% 的農藥種類最多。使用 PSA 凈化劑的回收率情況如圖3 所示，當 PSA 用量為 50 mg 時，平均回收率最高。因此確定 PSA 最佳用量為 50 mg。

圖3 不同PSA 用量對空白干紅棗基質添加回收率的影響Fig.3 Effect of the amount of PSA on recovery in blank dried dates

用類似方法確定杏、葡萄、香梨基質中 PSA最佳用量分別為 25、25 和50 mg。鑒于NH2凈化劑在本階段多個用量范圍表現出的低回收率，此處未進一步探究其余 3 種基質的最佳用量。

為去除類胡蘿卜素、葉綠素等色素類雜質，在PSA 和C18用量分別為50 mg 和25 mg 條件下，比較了GCB 用量分別為0、5、10 和15 mg時99 種農藥在干紅棗基質中的平均回收率。結果發(fā)現，回收率在70%～120% 的農藥比例分別為81%、70%、38% 和40%，即隨著GCB 用量增加，方法的準確性降低，符合要求的農藥比例越來越少；當GCB 用量大于10 mg 時，滴滴涕、六六六、六氯苯、百菌清、五氯硝基苯和異菌脲等農藥回收率顯著降低。此外，雖然GCB 用量為 0 mg時回收率最高，但凈化后溶液顏色相比GCB 用量為5 mg 時深。為降低設備維護頻率，確定干紅棗基質中GCB 最佳用量為5 mg。用類似方法確定杏、葡萄、香梨基質中GCB 最佳用量均為0。

2.2.4 凈化方法選擇 使用傳統(tǒng)SPE 凈化方法與不同凈化劑組合的方法，對比凈化效果 (仍以干紅棗基質為例)。

方法1： Carb/NH2固相萃取柱凈化(SPE)：按照標準方法[18]凈化。

方法2： 使用 NH2100 mg + C1825 mg + GCB 5 mg 混合凈化劑。

方法3： 使用 PSA 50 mg + C1825 mg + GCB 5 mg 混合凈化劑。

經比較：方法 1、2、3 中，99 種農藥的平均回收率分別為 104%、89%和100%，回收率在 70%～120% 的農藥比例分別為 60%、74%、81%。方法1 與方法 3 平均回收率相差不大，雖然使用 Carb/NH2固相萃取柱在凈化效果上略勝一籌，表現為凈化溶液更透明，在干紅棗這類高糖、低含水量的復雜基質中，除去色素的凈化效果更好，但相比方法 3 更耗時費力，需要更多的甲苯作溶劑，成本更高；從回收率符合范圍內的農藥比例看，使用 100 mg 的 NH2凈化劑與使用 50 mg 的 PSA凈化劑未呈現明顯差別，反映出二者具有相似的吸附特性，這可能與他們的結構類似有關，在滿足回收率要求前提下，其用量比 PSA 更多 (該用量恰好是 PSA 用量的 2 倍)，且不同 NH2用量對回收率結果影響較大，方法穩(wěn)健性相比使用 PSA略顯不足。NH2凈化劑結構中只有一個氨基，而PSA 凈化劑結構中含有兩個氨基，離子交換能力相比 NH2凈化劑更強。此外 NH2凈化劑在處理亞胺硫磷、乙酰甲胺磷等有機磷類目標物時，相比PSA 凈化劑表現為更低的回收率。方法 3 采用PSA + C18+ GCB 混合凈化劑能夠滿足檢測要求，且回收率相比方法 2 更穩(wěn)定，當處理杏、葡萄、香梨基質時，符合回收率要求 (70%～120%) 的化合物數量相比使用方法1 更多。因此選擇方法 3。3 種凈化方法的回收率以及回收率在 70%～120%的農藥占比情況見圖4。

圖4 3 種凈化方法對農藥回收率的影響 (re：回收率)Fig.4 3 cleaning-up methods on recovery of 99 pesticides(re means recovery)

2.3 基質效應的考察

按照方法 3，分別考察 4 種基質的基質效應，結果表明：在紅棗(干)、杏、葡萄、香梨 4 種基質中，均至少有 85% 的農藥體現為基質增強效應。干紅棗基質中，具有強、中等、弱基質效應的農藥分別有 84 、8 、7 個；杏基質中分別有89、5、5 個；葡萄基質中分別有56、36、7 個；香梨基質中分別有76 、17 、6 個。此外，α-六六六、γ-六六六、δ-六六六等農藥在4 種基質的基質效應均表現為弱基質效應，上述農藥受基質干擾的影響不大。干紅棗基質中，因水分含量低，含糖量高，具有基質增強效應的農藥比例相比葡萄、香梨基質的更高。因此，在定量分析中根據樣品類型分別選擇對應的空白基質，采用基質匹配校準方法以降低基質效應。

2.4 方法的線性范圍和定量限

分別向紅棗 (干)、杏、葡萄和香梨空白基質溶液中添加一定量的標準溶液，配制成質量濃度分別為 0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2 和0.5 mg/L 的基質匹配混合標準工作溶液，按照 1.2.1節(jié)條件、方法 3 測定，以各化合物的定量離子對的峰面積為縱坐標、對應的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，以各農藥信噪比為 10 時的濃度計算定量限 (LOQ)。結果 (表2) 表明：99 種農藥在0.005～0.5 mg/L 范圍內均成良好的線性關系，決定系數 (R2) 均大于0.99， LOQ 在 0.01～0.025 mg/kg之間。

表2 99 種農藥分別在紅棗(干)、杏、葡萄、香梨基質中的定量限、決定系數、回收率和相對標準偏差(n = 5)Table 2 The limit of quantification (LOQ), determination coefficients (R2), recovery (Re) and relative standard deviation (RSD) of the 99 pesticides in dried red dates, apricots,grapes and pears (n = 5)

續(xù)表2Table 2 (Continued)

續(xù)表2Table 2 (Continued)

續(xù)表2Table 2 (Continued)

續(xù)表2Table 2 (Continued)

2.5 方法的正確度與精密度

分別向空白紅棗 (干)、杏、葡萄和香梨中添加 0.01、0.025、0.05 和 0.1 mg/kg 4 個水平的混合標準溶液，每個水平重復 5 次，計算回收率和相對標準偏差 (RSD)。結果 (表2) 表明：4 種基質總體平均回收率和 RSD 分別為：60%～138%，0.3%～20%，其中 95 種農藥的回收率在 70%～120%，占總數的 96%，表明方法的正確度和精密度基本滿足相關法規(guī)限量要求[22]，可以用于上述農藥殘留的日常篩查與檢測。

2.6 實際樣品檢測

利用所建立的方法，對采自本地市場、超市的89 份樣品 (包括11 份干紅棗，17 份梨，19 份杏，16 份桃，6 份李，20 份葡萄) 進行分析，結果 (表3) 發(fā)現有64 份樣品檢出農藥殘留，檢出頻率較高的農藥有：氯氰菊酯、啶蟲脒、氯氟氰菊酯、毒死蜱等，最高檢出量分別為0.38、0.28、0.18、0.056 mg/kg。其中24 份樣品檢出氯氰菊酯(檢出率27%)，20 份樣品檢出啶蟲脒 (檢出率22%)，17 份樣品檢出氯氟氰菊酯 (檢出率19%)。葡萄和桃中農藥檢出率較高，在同一份樣品中同時檢出 6 種農藥。上述農藥均未超出我國標準GB 2763—2021 規(guī)定的最大殘留限量。

表3 99 種農藥在實際樣本中的檢出情況表Table 3 The detection results of 99 pesticides in real samples

3 結論

對比分析了傳統(tǒng) SPE 方法與分別使用 NH2+C18+ GCB 和 PSA + C18+ GCB 分散固相萃取方法的凈化效果差異，通過凈化劑條件優(yōu)化，建立了紅棗 (干)、杏、葡萄和香梨 4 種果品基質中 99 種農藥的氣相色譜-串聯(lián)質譜分析方法。樣品用乙腈提取，氯化鈉鹽析，提取液最終經 PSA、C18、GCB 凈化。其中，干紅棗 (干果基質) 采用 PSA 50 mg + C1825 mg + GCB 5 mg 凈化；杏 (核果基質) 和葡萄 (漿果基質) 采用 PSA 25 mg + C18+10 mg 凈化；香梨 (仁果類基質) 采用 PSA 50 mg +C1810 mg 凈化，樣品經丙酮轉溶后采用 GCMS/MS 檢測。與已報到的水果中的農藥殘留測定的多數方法相比，本方法擴展了農藥的檢測范圍，實現了單次進樣，22 min 內完成全部分析，靈敏度、正確度和精密度均滿足農藥殘留分析測定和限量要求，操作簡單，成本低，可作為快速篩查和確證方法，用于上述基質日常樣品農藥殘留量的分析。