段 云, 關(guān) 妮, 馬 晨, 陳棠鉆, 羅金輝, 魏 靜

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 分析測試中心，國家市場監(jiān)管重點實驗室 (熱帶果蔬質(zhì)量與安全)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱作產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室 (?？?，海南省熱帶果蔬質(zhì)量安全重點實驗室，海口 571101；2.廣西科學院國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，南寧 530007；3.海南省食品檢驗檢測中心，?？?570314)

杧果是我國四大熱帶水果之一，主要種植于海南、廣西、云南、四川、廣東、福建和臺灣等地區(qū)。熱帶和亞熱帶濕熱氣候常導致杧果生產(chǎn)中病蟲害頻發(fā)，杧果炭疽病、細菌性角斑病和露水斑病等主要病害在果期的發(fā)生率分別高達60%以上[1-2]，其中炭疽病尤為突出。杧果炭疽病是由膠孢炭疽菌Colletorichum gloesporioidesPenz 侵染引起的真菌病害，主要為害杧果葉片、嫩梢、花和果實，造成生長期葉斑、梢枯、落花和落果，其潛伏性侵染特性也是導致果實貯藏期間腐爛的重要原因[3]。2019—2020 年實地調(diào)研了解，杧果炭疽病作為潛伏性病害在采前發(fā)病率較高，為減少經(jīng)濟損失，生產(chǎn)者通常會使用甲氧基丙烯酸酯、三唑類等殺菌劑進行防治。

甲氧基丙烯酸酯和三唑類殺菌劑是防治杧果炭疽病常用化學藥劑，具有高效、廣譜抗菌、內(nèi)吸性強和持效期長等特點，是全球銷售額 (2014 年)居前2 位的殺菌劑產(chǎn)品類型[4]。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑作用機制是通過阻止電子從細胞色素b 到細胞色素c1之間的傳遞，阻礙三磷酸腺苷的產(chǎn)生，抑制線粒體的呼吸而產(chǎn)生抑菌作用[5]。三唑類殺菌劑是通過三唑環(huán)與病原菌中鐵卟啉中心鐵源自配位，阻礙鐵卟啉鐵氧絡合物的形成，影響病菌細胞膜的發(fā)育從而導致子囊菌、半知菌、擔子菌等真菌異常生長，實現(xiàn)防病治病[6-7]。

高度的化學穩(wěn)定性和較長的半衰期，導致甲氧基丙烯酸酯和三唑類殺菌劑在食品中的質(zhì)量安全隱患。研究表明，苯醚甲環(huán)唑在云南和海南兩地杧果中的半衰期達13.2 d 和10.6 d[8]，戊唑醇在葡萄中的半衰期為9.9 d～12.2 d[9]。安徽、江蘇、浙江和福建等4 個省份芹菜和番茄中三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑的檢出率分別為23.1% 和20.4%，黃瓜中的抑霉唑檢出率為16.3%，其中黃瓜對三唑類殺菌劑累積暴露量貢獻最大[10]。

為探明甲氧基丙烯酸酯和三唑類殺菌劑在我國鮮食杧果中的殘留水平及膳食攝入風險，本研究基于實地調(diào)研，以杧果生產(chǎn)上使用的8 種甲氧基丙烯酸酯類和5 種三唑類殺菌劑為對象，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，應用于我國杧果主產(chǎn)區(qū)和消費市場1056 份全果樣品的殘留分析，并運用點評估法對13 種殺菌劑開展兒童和成人的長期和短期膳食攝入風險評估，旨在探明我國杧果產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的潛在健康危害程度從而有針對性地開展質(zhì)量安全監(jiān)管和生產(chǎn)過程風險控制提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 杧果樣品 2019—2020 年，在海南、廣西、云南和四川等杧果主產(chǎn)區(qū)和消費城市 (北京、上海、杭州、南京和西安等) 采集杧果主栽品種(臺農(nóng)、貴妃、金煌、桂熱82 號和凱特等)果實，共計1056 份。樣品采集后立即置于聚乙烯封口袋中，24 h 內(nèi)進行全果去核、切塊、勻漿，于 -20 ℃冷凍保存，備用。

1.1.2 藥劑及試劑 13 種殺菌劑標準品：吡唑醚菌酯、嘧菌酯、醚菌酯、肟菌酯和啶氧菌酯5 種甲氧基丙烯酸酯殺菌劑，苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、丙環(huán)唑、腈菌唑、氟硅唑、腈苯唑、氟環(huán)唑和三唑醇8 種三唑類殺菌劑，均為混標乙腈溶液100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司。QuEChERS前處理試劑盒鹽包 (含1.5 g 乙酸鈉和6.0 g 硫酸鎂), QuEChERS Extract Pouch, AOAC Method, 美國Agilent 公司；色譜純甲酸、甲醇和乙腈，美國Fisher 公司；Milli-Q 凈化系統(tǒng)經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾的純凈水。

1.1.3 主要儀器設備 SCIEX 高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀Triple QuadTM6500 配備電噴霧離子源(ESI) 和 Analyst?1.7 工作站、定量軟件SCIEX OS-Q 1.4.0.180 67 版本，美國AB Sciex 公司；Zorbax Eclipse Plus C18(2.1 mm × 50 mm，1.8 μm)色譜柱，美國Agilent 公司; Tekmar AutoMate-Q40 全自動QuEChERs 樣品前處理平臺，美國Tekmar 公司；電子分析天平 (0.01g)，梅特勒-托利多國際貿(mào)易 (上海) 有限公司。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品前處理 杧果勻漿樣品解凍后，準確稱取10.0 g 樣品于50 mL 聚丙烯離心管中，依次加入1 份QuEChERS 試劑盒鹽包 (7.5 g) 和20.0 mL乙腈，置于全自動QuEChERs 樣品前處理平臺上，上下振蕩10 min 后，于4000 r/min 下離心5 min；取1 mL 上清液與50% 甲醇水按體積比1 : 1 定容，經(jīng)0.22 μm 有機微孔濾膜過濾，待測。

1.2.2 檢測條件

色譜條件：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm × 50 mm，1.8 μm)，流動相為甲醇和1 mmol/L 甲酸水溶液二元梯度洗脫；柱溫40 ℃；樣品室溫25 ℃；流速0.25 mL/min；進樣量2 μL。梯度洗脫程序如表1 所示

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

質(zhì)譜條件：正離子電離模式 (ESI+)，多反應監(jiān)測 (MRM) 模式; 離子化 (IS) 電壓5.5 kV；離子源溫度 550 ℃；氣簾氣 (CUR) 276 kPa；碰撞氣 4 kPa離子源氣體1 和氣體2 壓力均為345 kPa；碰撞能量 (CE) 和去簇電壓 (DP) 等參數(shù)見表2。

表2 多反應監(jiān)測模式下的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameters in MRM mode

1.3 標準溶液配制及標準曲線繪制

準確量取1.0 mL 標準品溶液，用乙腈稀釋，配制成13 種農(nóng)藥的混合標準儲備液10 μg/mL，于-18 ℃避光保存。再用乙腈將混合標準儲備液稀釋，配制成1、5、10、25、50 和100 ng/mL 的混合標準工作溶液?？瞻讝x果樣品按照1.2.1 節(jié)方法進行前處理后作為基質(zhì)液，加入不同體積的混合標準工作溶液，配制成基質(zhì)匹配標準工作溶液，以基質(zhì)標準工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應化合物定量離子對峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.4 添加回收試驗和基質(zhì)效應

1.4.1 添加回收試驗 稱取10.0 g 杧果空白樣品，分別加入1、5、10、50 和100 μL 質(zhì)量濃度為10 μg/mL 混合標準儲備液，按照1.2.1 節(jié)的方法進行前處理，每個濃度平行測定5 次，計算平均回收率及相對標準偏差 (RSD)。

1.4.2 基質(zhì)效應 杧果中存在有機酸、糖和色素等物質(zhì)，可能與待測農(nóng)藥產(chǎn)生相互作用，對農(nóng)藥化合物在質(zhì)譜離子源形成帶電離子時產(chǎn)生增強或減弱的基質(zhì)效應，從而影響定量分析的準確度和重現(xiàn)性?；|(zhì)效應 (Me) 按公式 (1) 計算，通常正值表示基質(zhì)增強，負值表示基質(zhì)抑制。當基質(zhì)效應在 -20% ≤Me≤ 20% 時，為較低程度的基質(zhì)干擾；當 -50% ≤Me＜ -20% 或20% ＜Me≤50%時，為中等程度的基質(zhì)干擾；當Me＜ -50%或Me＞ -50%時，為強烈程度的基質(zhì)干擾[11]。

其中，A為某農(nóng)藥在基質(zhì)溶液中的質(zhì)譜響應值；B為某農(nóng)藥在純?nèi)軇┲械馁|(zhì)譜響應值。

1.5 膳食攝入風險評估

1.5.1 長期攝入風險 長期暴露通常是指基于整個生命周期某物質(zhì)低劑量的暴露，通過計算每日攝入的食物來源中某種物質(zhì)攝入量，并將實際每日估算攝入量 (EDI) 與每日允許攝入量 (ADI) 進行比對，如果大于100%ADI 則表示存在長期暴露風險，小于100%ADI 表示長期暴露風險在可接受范圍[10]。長期膳食暴露計算公式 (2) 和 (3)：

式 (2) 中EDI 表示食品中某化合物的每日攝入量估計值mg/kg(bw)；CONCi為第i種食品中某化合物的污染值，mg/kg；CONSi為第i種食品的平均消費量，g/d；PFi為第i種食品的加工因子，bw 為體重，kg，式 (3) 中RQ 為長期暴露風險商。

1.5.2 短期攝入風險 短期暴露通常是針對已制定急性參考劑量 (ARfD) 的化合物，在特定人群中短期內(nèi) (一餐或24 h 內(nèi)) 的膳食暴露。ARfD 表示短期內(nèi)通過膳食和飲水攝入的化合物，不會對消費者產(chǎn)生可觀察到健康風險的劑量[12]。自1997 年JMPR (Joint Meeting of Pesticide Residues) 引入了評估農(nóng)藥殘留的短期膳食暴露方法后，對評估的方法學進行了細化，將短期暴露評估分為4 種情況[13]，其中鮮食杧果的短期暴露屬于情形2a，即每餐份原料食品單位可食部質(zhì)量小于大份額食品質(zhì)量[12]，也就是每餐份杧果可食部分質(zhì)量小于杧果大份額消費量的情況。短期膳食暴露按公式 (4)和 (5) 計算。

式 (4) 中，IESTI 表示食品中某化合物的短期膳食攝入估計值mg/kg(bw)； LP (kg) 為某食品的大份額消費量，指每日消費量的高 (P97.5) 百分位數(shù)；Ue(kg) 是以可食部分計的產(chǎn)品單個平均質(zhì)量由產(chǎn)品單個質(zhì)量和可食部分百分比計算得到；HR(mg/kg) 為基于規(guī)范田間殘留試驗得到的復合樣品可食部分最高殘留值或食品中某化合物監(jiān)測數(shù)據(jù)的高殘留值(97.5th百分位點)；v為變異因子，表示一批產(chǎn)品中不同個體或同一個體中不同部位的平均殘留值與最高殘留值之間的差距，一般取3。式 (5) 中，%ARfD 表示短期膳食暴露風險商，值越小風險越低，當%ARfD 大于100%時風險不可接受[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法有效性評價

結(jié)果(表3)顯示：吡唑醚菌酯等13 種殺菌劑在質(zhì)量濃度1～100 μg/L 范圍內(nèi)其峰面積與對應化合物的質(zhì)量濃度間呈現(xiàn)較好線性關(guān)系。添加回收試驗結(jié)果表明：在1、5、10、50 和100 μg/kg 添加水平下，13 種殺菌劑的平均回收率在76%～122%之間，相對標準偏差0.7%～14% (n= 5)。該方法的檢出限 (LOD) 為1 μg/kg， 定量限 (LOQ)為5 μg/kg，符合農(nóng)藥殘留檢測要求[14]。

表3 13 種殺菌劑的線性方程、決定系數(shù)和定量限(線性范圍：1～100 ng/mL)Table 3 The linear equation, coefficient of determination and LOQ of 13 fungicides (Linear range: 1-100 ng/mL)

杧果中13 種殺菌劑的基質(zhì)效應如表4 所示：5 種甲氧丙烯酸酯類殺菌劑的Me在 -16.6%～23.6%，除吡唑醚菌酯在1 μg/L 時(Me= 23.6%)屬于中等程度的基質(zhì)干擾外，其余4 種均為較低程度的基質(zhì)干擾，8 種三唑類殺菌劑的Me在 -13.1%～17.5%之間，均屬于較低程度的基質(zhì)干擾。研究表明，當基質(zhì)效應為較低程度時，可省去配制基質(zhì)標準溶液的步驟，直接使用溶劑標準溶液進行定量[15]。

表4 13 種殺菌劑在杧果中的平均添加回收率、相對標準偏差和基質(zhì)效應 (n = 5)Table 4 Recovery, RSD and Me of 13 fungicides in mangoes at 5 different spiked levels (n = 5)

2.2 杧果中甲氧基丙烯酸酯和三唑類殺菌劑殘留分析

1056 份杧果樣品中13 種殺菌劑的檢出率如圖1所示，其中吡唑醚菌酯 (22.6%) 和嘧菌酯 (18.5%)在甲氧基丙烯酸酯類中檢出率較高，苯醚甲環(huán)唑(15.5%) 和戊唑醇 (4.9%) 在三唑類中檢出率較高。

圖1 杧果中13 種甲氧基丙烯酸酯和三唑類殺菌劑的檢出率 (2019—2020)Fig.1 The detection rate of 13 strobulurin and triazole fungicides in mango samples (2019-2020)

單份樣品中的農(nóng)藥多殘留情況能反映出生產(chǎn)者在種植過程中的農(nóng)藥使用習慣，也可以評估潛在的毒性累積效應[10]。杧果全果中兩類殺菌劑的多殘留情況如圖2 所示，單份樣品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑檢出1 種占26.3%，2 種占8.2%，3 種及以上占0.7%，最多檢出4 種，其中共殘留比例最高的是吡唑醚菌酯與嘧菌酯組合，其次為吡唑醚菌酯與肟菌酯組合。單份樣品中三唑類殺菌劑檢出1 種占16.9%，2 種占2.7%，3 種及以上占0.6%，3 份樣品中共檢出4 種，共殘留比例最高的是苯醚甲環(huán)唑與戊唑醇組合。

圖2 杧果中甲氧基丙烯酸酯類(a)和三唑類(b)殺菌劑多殘留情況Fig.2 The percentage of detected strobulurin (a) and trizole (b) fungicides in mangoes

表5 為杧果樣品中13 種殺菌劑的殘留水平、我國杧果的殘留限量 (MRL)標準[16]、超標率和國際食品法典委員會(CAC)[17]、歐盟[18]及其他國家的殘留限量 (美國[19]、日本[20]、韓國[21])。依據(jù)我國GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[16]判定，吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、嘧菌酯和啶氧菌酯等5 種殺菌劑在杧果樣品中的超標率分別為6.9%、2.1%、1.0%、0 和0，另外8 種殺菌劑因未制定MRL 而無法判定。相比較，我國杧果吡唑醚菌酯殘留限量較為嚴格 (0.05 mg/kg)，CAC 和歐盟已于2019 年將吡唑醚菌酯制定臨時參考限量 (0.05 mg/kg)，按照既定的程序，重新評估后為0.6 mg/kg，若參考CAC限量對杧果中吡唑醚菌酯的殘留再次判定，其超標率僅為0.2%。另外，1056 份樣品中檢出的醚菌酯、氟硅唑和丙環(huán)唑3 種殺菌劑在我國杧果中暫未制定限量，若參考CAC、歐盟和韓國的限量標準判定，分別有0.6% (醚菌酯，CAC 0.1 mg/kg)、0.3% (氟硅唑，歐盟0.01 mg/kg) 和0.2% (丙環(huán)唑，韓國0.3 mg/kg) 超標。

表5 杧果中甲氧基丙烯酸酯和三唑類殺菌劑的殘留和超標情況Table 5 The residue level and violation rate of strobilurin and triazole fungicides in mangoes

2.3 膳食攝入風險評估

杧果中13 種殺菌劑長期和短期膳食攝入風險評估結(jié)果如表6 所示，5 種甲氧基丙烯酸酯和8 種三唑類殺菌劑的ADI 值在0.01～0.4 mg/kg (bw)[21]，已制定ARfD 的9 種殺菌劑急性參考劑量在0.02～0.3 mg/kg(bw)。當13 種殺菌劑殘留值低于LOD時統(tǒng)一賦值1/2 LOD[22-23]。

表6 杧果中甲氧基丙烯酸酯類和三唑類殺菌劑對不同人群的短期和長期膳食攝入風險Table 6 The long-term and short-term exposure risk of strobilurin and triazole from the dietary of mangoes for subgroups

2.3.1 長期膳食攝入風險評估 基于點評估方法[24]。運用1.5.1 節(jié)公式 (2) 分別將13 種殺菌劑50th百分位數(shù)的殘留值，參照WHO CiFoCoss (Chronic Individual Food Consumption Database-Summary Statistics) 數(shù)據(jù)取我國不同人群杧果的平均消費量[25]，加工因子設為1，成人和兒童體重分別按照60 kg 和15 kg 計，計算杧果中殺菌劑殘留的長期攝入風險。值得一提的是，開展長期膳食上風險評估需考慮某農(nóng)藥化合物從所有攝入食品中的來源，而不僅是某一種食品，因此運用杧果中13 種殺菌劑的殘留數(shù)據(jù)代入公式 (2) 計算，并不能代表殺菌劑殘留的長期攝入風險評估結(jié)果，僅表示杧果攝入吡唑醚菌酯等13 種殺菌劑的殘留對長期膳食攝入風險商RQ 的貢獻率(RQ%)[24]。評估結(jié)果顯示，通過杧果攝入甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留量對長期膳食攝入風險商的貢獻率在兒童和成人中分別為0.01%～0.1%和0.01%～0.2%，三唑類殺菌劑分別為0.01%～0.3%和0.1%～0.5%。

2.3.2 短期膳食攝入風險評估 運用1.5.2 節(jié)公式(4)，杧果中殺菌劑殘留值數(shù)據(jù)的97.5th百分位數(shù)作為HR (杧果監(jiān)測數(shù)據(jù)量充足)，參考荷蘭一般人群 (＞1 歲) 杧果LP 膳食數(shù)據(jù)0.432 0 (kg/d) 和Ue值(以可食部分計的產(chǎn)品單個質(zhì)量) 0.288 8 (kg)[26](我國暫無杧果LP 膳食數(shù)據(jù))，成人和兒童體重分別按照60 kg 和15 kg 計，計算杧果中9 種殺菌劑的短期攝入風險。評估結(jié)果顯示，杧果中2 種甲氧基丙烯酸酯殺菌劑殘留在兒童和成人中的短期膳食攝入風險商 (%ARfD) 分別為0.1～28.9 和0.02～7.2，7 種三唑類殺菌劑分別為0.02～4.1 和0.01～1.0。嘧菌酯、醚菌酯、肟菌酯和氟環(huán)唑4 種殺菌劑屬于沒有必要制定ARfD 的化合物，無需計算其短期攝入風險。

3 討論與結(jié)論

3.1 13 種殺菌劑在杧果上的登記和殘留限量制定情況

截至2022 年7 月，經(jīng)查詢中國農(nóng)藥信息網(wǎng)(http://www.icama.org.cn/)，有效期內(nèi)登記用于防治杧果炭疽病、細菌性黑斑病等病害的農(nóng)藥產(chǎn)品有61 個。本文驗證分析的13 種殺菌劑中未登記的有7 種，分別為醚菌酯、丙環(huán)唑、腈菌唑、氟硅唑、腈苯唑、氟環(huán)唑和三唑醇，在杧果中檢出率為0.1%～1.5%。從我國是否已制定殘留限量標準看，已登記但未制定殘留限量標準的農(nóng)藥有肟菌酯，既未登記又無殘留限量標準的農(nóng)藥有丙環(huán)唑、腈菌唑、氟硅唑、腈苯唑、氟環(huán)唑和三唑醇。

3.2 膳食攝入風險分析

從兒童和成人的膳食暴露風險評估結(jié)果看，杧果中13 種殺菌劑殘留的RQ%分別為0.01～0.3和0.01～0.5，9 種殺菌劑的%ARfD 分別為0.02～28.9 和0.01～7.2，%ARfD 相對突出的為吡唑醚菌酯，在兒童和成人中分別為28.9 和7.2，但均在風險接受范圍內(nèi)。依據(jù)GB 2763—2021[16]，吡唑醚菌酯在我國蔬菜和水果中已制定殘留限量標準66 項次，產(chǎn)生膳食攝入風險的食品來源較多，在杧果中其RQ%雖然較低，但不能確定其長期膳食風險的可接受程度。

點評估法計算長期和短期膳食攝入風險步驟簡便，但評估結(jié)果不確定性較高。在短期膳食攝入風險評估方面，由于缺乏我國消費人群數(shù)據(jù)，參考荷蘭人的杧果膳食數(shù)據(jù)LP 和Ue，增加了評估結(jié)果的不確定性。在殘留監(jiān)測數(shù)據(jù)方面，由于杧果的采樣量大，殘留數(shù)據(jù)較為具有代表性，在此條件下運用50th和97.5th百分位點的殘留值代替殘留中值和最大殘留值 (HR) 可有效降低評估結(jié)果的不確定性。另外，點評估的方法計算結(jié)果通常為點值，缺少不同人群膳食攝入的分布數(shù)據(jù)，因而評估結(jié)果未能反映杧果中殺菌劑殘留在不同人群中的風險概率分布情況。

3.3 結(jié)論

本研究建立了基于-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，杧果中5 種甲氧基丙烯酸酯和8 種三唑類殺菌劑的定量分析方法，并運用此方法對2019—2020年我國杧果主產(chǎn)區(qū)和主要消費城市的1056 份杧果全果樣品進行測定。樣品中吡唑醚菌酯、嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇檢出率相對較高，醚菌酯、丙環(huán)唑、腈菌唑、氟硅唑、腈苯唑、氟環(huán)唑和三唑醇等7 種殺菌劑屬杧果中超范圍使用農(nóng)藥(未登記)，今后需要加強監(jiān)管，參考CAC 和歐盟限量標準建議修訂吡唑醚菌酯的殘留限量，依照我國GB 2763—2021，建議制定肟菌酯的殘留限量。我國居民通過食用杧果攝入吡唑醚菌酯等13 種殺菌劑對長期風險商的貢獻率(%RQ)較低，9 種有推薦ARfD 的殺菌劑的短期膳食插入風險商(%ARfD) 均在可接受范圍。