張榮勝, 張 浩, 喬俊卿, 于俊杰, 齊中強, 劉永鋒

(江蘇省農業(yè)科學院 植物保護研究所，南京 210014)

農藥在防治農作物病蟲草害，保障糧食安全和重要農產品供給上發(fā)揮了關鍵作用。農藥藥液在噴霧過程中存在農藥霧滴漂移、蒸發(fā)和流失等現象[1-2]。此外噴霧農藥藥液在作物靶標表面會發(fā)生彈跳和飛濺行為，藥液在靶標表面的潤濕性差異也導致藥液大量流失，這一系列影響進一步降低農藥利用率，進而影響農藥的防治效果[2-4]。因此提高農藥利用率及農藥在作物表面的沉積量對于農藥的減量增效有著非常重要的意義。

噴霧助劑是影響藥液理化性質的主要因素，添加后可有效提高農藥利用率，被廣泛應用于草害和蟲害的防治[5]。噴霧助劑的主要類型有植物油類和表面活性劑類。其中植物油類助劑與植物親和性好，具有生物可降解、安全無毒和藥害少等特點[6]；表面活性劑類助劑可以通過降低表面張力、提高農藥藥液在靶標上的潤濕鋪展性能、溶解非極性植物物質 (部分葉面角質和蠟質層、細胞壁幾丁質)等而達到增效目的[7]。Xu 等[8]發(fā)現添加甲酯化大豆油后能顯著增強水滴在天竺葵蠟質葉片上的鋪展面積。徐鵬飛等[9]發(fā)現，添加卵磷脂桶混助劑后，氟啶蟲胺腈在有效成分含量為45～75 g/hm2時對稻飛虱的防治效果比未添加桶混助劑對應處理的防治效果提高了9.04%～41.77%；Preftakes 等[10]比較了在2 種不同劑型 (懸浮劑和可濕粉劑) 的多殺菌素產品中分別添加助劑Maximizer和Powerlock，均可有效降低噴灑過程中藥液的損失。楊帆等[11]將有機硅稀釋1000 倍后與烯酰嗎啉混用，發(fā)現有機硅可顯著提高烯酰嗎啉對萵苣霜霉病的防治效果；張偉等[12]研究發(fā)現，杰效利、喜施和絲潤3 種新型有機硅助劑稀釋500～3000 倍液后噴施，會對大櫻桃紅燈品種產生不同程度的藥害，且藥害程度和藥害果率隨著助劑添加量提高而增加。目前噴霧助劑已經廣泛應用于除草和殺蟲領域，而在微生物殺菌劑方面的應用鮮有報道。

芽胞桿菌Bacillussp.可以通過分泌抗菌物質、營養(yǎng)和空間競爭、誘導植物產生抗病性等多種機制來防治植物病害[13]。目前登記的劑型以可濕性粉劑和懸浮劑為主[14]，傳統劑型農藥利用率低，潤濕效果不佳。生防菌Lx-11 是由江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所水稻病害研究室前期篩選獲得的一株解淀粉芽胞桿菌，對白葉枯病和條斑病具有良好的防治效果[15]。隨著自走式噴桿噴霧機、農用無人機等噴霧器械在農業(yè)生產中的大面積應用，為進一步提高解淀粉芽胞桿菌對病害的防治效果，我們研究了不同種類的4 種噴霧助劑 (有機硅、TM-10、SY-6535 和卵磷脂) 對解淀粉芽胞桿菌Lx-11 含菌量的影響，測定其表面張力和接觸角的變化，并研究其對水稻幼苗生長等安全性，選取最適噴霧助劑測定其防治效果和對解淀粉芽胞桿菌定殖的影響，旨在為生防芽胞桿菌的田間高效應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

病原菌菌株：水稻白葉枯病菌Xanthomonas oryzaepv.oryzaeZ173[16]，由江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所水稻病害研究團隊提供。

種子液培養(yǎng)基 (YPG)：葡萄糖5.0 g，胰蛋白胨5.0 g，酵母浸膏5.0 g，用去離子水定容至1000 mL，用1 mol/L NaOH 調節(jié) pH = 7.0。固體培養(yǎng)基 (YPGA) 是在種子液培養(yǎng)基的基礎上加入17.0 g 瓊脂粉。馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基 (PSA)：蔗糖20.0 g，馬鈴薯200.0 g，瓊脂17.0 g，用去離子水定容至1000 mL，用1 mol/L NaOH 調節(jié) pH = 7.0。

供試水稻品種：金剛30，試驗期內溫室內灌水、施肥條件一致。

藥劑：解淀粉芽胞桿菌Lx-11 懸浮劑 (Bacillus amyloliquefaciensLx-11 SC)，江蘇省蘇科農化有限責任公司。

供試噴霧助劑的類型、有效成分及廠家見表1。

表1 供試助劑類型、有效成分及廠家Table 1 Types of test spray adjuvants, active ingredients and factories

1.2 試驗儀器

DCAT 11EC 全自動表面張力儀 (DatePhysics Instruments)；JC2000C 接觸角測試儀 (上海中晨數字技術設備有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 噴霧助劑臨界膠束濃度 (CMC) 的確定 將供試噴霧助劑配制成質量濃度分別為62.5、125、250、500、1000、2000、4000 和8000 mg/L 的溶液，利用全自動表面張力儀測定其表面張力 (γ)，每處理重復測定5 次。利用Origin 2019b 繪制γlg?圖像，曲線轉折點即為該助劑的CMC[17]。

1.3.2 噴霧助劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11 含菌量和菌落生長的影響 按照4 種助劑各自CMC 值200% 的用量添加到Lx-11 懸浮劑，分別在1、30 和90 d 時吸取 1 mL 懸浮液，用無菌水稀釋106、107、108倍后分別涂于 YPGA 平板上，取等體積未添加助劑的Lx-11 懸浮劑作為對照，于 36 ℃培養(yǎng)，每處理 3 次重復，于12～24 h 后觀察平板上Lx-11 的菌落數，并計算菌落形成單位 (cfu)[18]，評估噴霧助劑對懸浮液中含菌量的影響。

噴霧助劑對菌落生長的影響：分別吸取5 μL添加上述助劑的懸浮液，滴于YPGA 平板中央，置于36 ℃下培養(yǎng)，每處理 3 次重復，分別在3 d和5 d 觀察菌落大小，評估噴霧助劑對菌落生長的影響。

1.3.3 噴霧助劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11 藥液表面張力的影響 根據4 種助劑各自的CMC 值，設定其在后續(xù)試驗中質量濃度分別為CMC 值的0.2、0.5、0.8、1、1.5 和2 倍[19]。將Lx-11 懸浮劑稀釋到100 倍 (田間使用濃度) 作為對照 (CK)，然后依照設定的質量濃度分別添加各噴霧助劑進行試驗。

1.3.4 噴霧助劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11 藥液在水稻葉片上接觸角的影響 將藥液按照1.3.3 節(jié)設定的質量濃度添加各噴霧助劑后供試。采集新鮮的水稻葉片，不破壞其葉片結構，將其平整的固定在接觸角測量儀上，使其保證自然狀態(tài)，在密閉環(huán)境中用微量進樣器移取10 μL 藥滴滴在水稻葉片正面，立即用接觸角測定儀測定各處理藥液的接觸角，從滴加藥液開始，30 s 內完成測量，每處理5 次重復，取其平均值[20]。以Lx-11 懸浮劑稀釋100 倍后所測定的接觸角作為對照 (CK)。

1.3.5 噴霧助劑對水稻生長的影響 在水稻苗期(4～5 葉期)，按照噴霧助劑各自CMC 值的200%的用量對水稻幼苗進行噴灑，15 d 后測量水稻幼苗的根長、株高、鮮重和干重。

1.3.6 盆栽試驗 試驗共設4 個處理。處理1：4.0 × 109cfu/mL Lx-11 懸浮劑；處理2：4.0 × 109cfu/mL Lx-11 懸浮劑加助劑SY-6535 (250 mg/L)；處理3：4.0 × 109cfu/mL Lx-11 懸浮劑加助劑TM-10 (1000 mg/L)；處理4：蘸菌剪葉接種后，噴施清水 (CK)。每處理3 個重復，試驗期間不施用其他殺菌劑，其他栽培管理措施一致。

在接種水稻白葉枯病菌前施藥，間隔 7 d 左右進行第 2 次施藥，在2 次施藥后14 d 測量發(fā)病葉片病斑長度，參考文獻方法[21]計算防治效果。

1.3.7 解淀粉芽胞桿菌 Lx-11 在水稻葉面的定殖規(guī)律 添加助劑與不加助劑 (CK) 的Lx-11 懸浮劑于水稻3 葉期噴施進行后續(xù)定殖試驗。分別于噴施后 0、1、3、5 和7 d 采集水稻葉片 (長約 5 cm葉段)，剪碎后放入試管，加入 5 mL 無菌水，于30 ℃、200 r/min 下振蕩培養(yǎng) 1 h，然后用無菌去離子水稀釋為10-3、10-4、10-5和10-6倍，分別涂布在YPGA 平板上，統計菌落數 (cfu)[22]。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 21.0 對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 噴霧助劑CMC 值的確定與添加濃度的設定

通過測定4 種助劑的表面張力值，確定有機硅和卵磷脂的CMC 值均為1000 mg/L，TM-10 為500 mg/L，SY-6535 為125 mg/L (圖1)。根據CMC 值，設定后續(xù)試驗中有機硅和卵磷脂的質量濃度依次是200、500、800、1000、1500 和2000 mg/L，TM-10 的質量濃度依次為100、250、400、500、750 和1000 mg/L，SY-6535 的質量濃度為25、62.5、100、125 和187.5、250 mg/L。

圖1 噴霧助劑質量濃度 (?) 與表面張力 (γ) 的γ-lg ? 圖Fig.1 The γ-lg ? diagram of mass concentration (?) and surface tension (γ) of spray adjuvants

2.2 噴霧助劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11 含菌量的影響

涂板法測定結果表明：添加不同助劑的Lx-11 懸浮劑放置1 d 后其含菌量與同期CK 相比無顯著差異。分別放置30 與90 d 后發(fā)現，添加卵磷脂的懸浮液中含菌量與同期CK 相比顯著降低，而添加SY-6535、有機硅和TM-10 后，懸浮液中含菌量與同期CK 相比無顯著差異 (圖2)。

圖2 4 種噴霧助劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11 含菌量的影響Fig.2 Effects of four spray adjuvants on the bacterial content and growth of B.amyloliquefaciens Lx-11 strain

噴霧助劑對Lx-11 菌株菌落生長的測定結果顯示：第3 天時，僅TM-10 處理與CK 相比無顯著差異；第5 天時SY-6535 和TM-10 處理菌落直徑分別為46.15 和46.20 mm，與CK (47.25 mm)相比無顯著差異 (表2)。由此可見，不同類型的噴霧助劑對Lx-11 含菌量影響和菌落生長存在差異性。

表2 4 種噴霧助劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11 生長的影響Table 2 Effects of four spray adjuvants on the growth of B.amyloliquefaciens Lx-11 strain

2.3 噴霧助劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11 懸浮劑藥液表面張力的影響

測定結果顯示：未添加噴霧助劑的Lx-11 懸浮劑的表面張力為49.12 mN/m。由圖3 可以看出：除了添加卵磷脂外，添加其他助劑均能有效地降低懸浮劑藥液的表面張力，其中以有機硅的效果最好；當添加助劑的質量濃度分別為200、500、800、1000、1500 和2000 mg/L 時，所對應的懸浮劑稀釋100 倍液的表面張力分別為23.21、22.57、22.51、22.49、22.28 和22.22 mN/m (圖3A)；隨著TM-10 和SY-6535 添加量的增加，藥液表面張力低于30 mN/m (圖3B和3C)?？梢?，添加噴霧助劑后可迅速降低藥液的表面張力，但隨著噴霧助劑質量濃度的增大，藥液表面張力降低的幅度趨于平緩。

圖3 噴霧助劑不同濃度對懸浮劑表面張力的影響Fig.3 Effects of different concentrations of spray adjuvants on the surface tension of the suspension concentrate

2.4 噴霧助劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11 懸浮劑藥液在水稻葉片上接觸角的影響

測定結果表明，隨著噴霧助劑質量濃度的增大，藥液與水稻葉片的接觸角都有不同程度的減少。當助劑的質量濃度分別為200、500、800、1000、1500 和2000 mg/L 時，懸浮劑稀釋100 倍后，添加不同濃度有機硅的接觸角范圍為88.90°～0°；添加卵磷脂的接觸角范圍為121.72°～111.68°(圖4A)。當助劑的質量濃度分別為100、250、400、500、750 和1000 mg/L 時，添加TM-10 的接觸角范圍為102.64°～0° (圖4B)；當助劑的質量濃度分別為25、62.5、100、125、187.5 和250 mg/L時，添加SY-6535 后藥液的接觸角范圍為81.05°～0°(圖4C)。

圖4 噴霧助劑不同濃度對懸浮劑接觸角的影響Fig.4 Effects of different concentrations of spray adjuvants on the contact angle of the suspension concentrate

綜上所述，添加有機硅、TM-10 和SY-6535等噴霧助劑能有效降低解淀粉芽胞桿菌Lx-11 懸浮劑與水稻葉片上的接觸角，而當噴霧助劑的添加量為CMC 值時，藥液的接觸角均小于45° (表3)，葉滴在水稻葉片表面迅速潤濕，可有效減少藥液的流失。

表3 4 種噴霧助劑對解淀粉芽胞桿菌Lx-11 懸浮劑接觸角的影響Table 3 Effects of four spray adjuvants on the contact angle of B.amyloliquefaciens Lx-11 suspension

2.5 助劑對水稻幼苗生長的影響

選取噴霧助劑表面張力和接觸角均較低的SY-6535、TM-10 和有機硅進行水稻幼苗 (4 葉期)生長安全性評價試驗。結果 (表4) 表明：噴施3 種助劑的水稻幼苗均可正常生長，未出現藥害現象。其中噴施SY-6535 的水稻根長和株高指標顯著高于噴施有機硅，而噴施有機硅和TM-10 后水稻的根長、株高、鮮重和干重與CK 相比無顯著性差異。由此可見，這3 種助劑與CK 相比對水稻幼苗生長均無顯著影響。

表4 噴霧助劑對水稻生長的影響Table 4 Effects of spray adjuvants on rice growth

2.6 盆栽試驗

通過評估助劑對Lx-11 生物相容性、接觸角以及對水稻幼苗生長等方面的綜合評價，最終選取添加噴霧助劑TM-10 和SY-6535 來進行后續(xù)盆栽防治效果試驗。結果表明，未添加助劑的Lx-11懸浮劑對水稻白葉枯病的防治效果為50.49%，而添加1000 mg/L TM-10 和250 mg/L SY-6535 后，其防治效果分別為57.70%和56.56%，防治效果比CK 分別提高了14.28%和12.02% (表5，圖5)。

圖5 添加噴霧助劑的解淀粉芽胞桿菌Lx-11 對水稻白葉枯的防治效果Fig.5 Control efficacies of B.amyloliquefaciens Lx-11 with spray adjuvants on rice bacterial blight

表5 添加噴霧助劑的解淀粉芽胞桿菌Lx-11 對水稻白葉枯病的防治效果Table 5 Control efficacies of B.amyloliquefaciens Lx-11 with spray adjuvants against rice bacterial blight

2.7 解淀粉芽胞桿菌 Lx-11 在水稻葉面的定殖規(guī)律

將Lx-11 (菌體含量為 2.0 × 107cfu/mL) 噴施于3 葉期的水稻葉片上，回收后涂布于YPGA 平板進行菌量檢測。結果表明，噴施Lx-11 懸浮劑2 h 后，添加TM-10 和SY-6535 的處理在水稻葉面定殖菌量分別為1.07 × 105和7.4 × 104cfu/cm2，顯著高于CK (5.6 × 103cfu/cm2)，即隨著處理時間的增加，定殖芽胞桿菌數量逐漸降低；添加TM-10并噴施處理后，1～7 d 檢測到芽胞桿菌的菌量保持相對穩(wěn)定，維持在104cfu/cm2，添加SY-6535 噴施處理后，1～7 d 檢測到芽胞桿菌的菌量略低于TM-10，但添加助劑的含菌量在各個時間段均顯著高于CK (圖6)。由此可見，添加助劑的懸浮劑顯著提高解淀粉芽胞桿菌在水稻葉片表面的定殖量。

圖6 解淀粉芽胞桿菌Lx-11 懸浮劑在水稻葉面上的定殖動態(tài)Fig.6 Colonization dynamics of B.amyloliquefaciens Lx-11 SC on rice leaves

3 結論與討論

藥液液滴大小、目標表面特性、環(huán)境是影響農藥效力和效率的重要因素，通過添加適宜的噴霧助劑可降低農藥的表面張力及其在作物表面的接觸角，促進藥液在作物表面的潤濕鋪展性，提高其在作物表面的沉積量，從而達到農藥減施增效的目的[23-24]。本研究首先測定了助劑與解淀粉芽胞桿菌Lx-11 的生物相容性，發(fā)現與對照相比，添加卵磷脂對解淀粉芽胞桿菌Lx-11 懸浮劑中的含菌量影響及對Lx-11 菌株生長的影響均顯著降低，而添加有機硅僅對Lx-11 菌株生長有顯著影響，菌落直徑顯著低于卵磷脂處理和對照，表明活體微生物對不同噴霧助劑的敏感性存在差異，推測隨著時間的增加可能會造成活體微生物死亡或者孢子自然萌發(fā)降解等。由于目前生產中自走式噴桿噴霧機和農用無人飛機被廣泛應用，通常會提前配制農藥母液，進行大面積噴霧時施藥時間也會相應延長，因此噴霧助劑對解淀粉芽胞桿菌含菌量的長期影響在實際應用中尤為重要，噴霧助劑添加不當，可能會影響生防制劑的田間防治效果。

王索等[25]測定了在30%苯唑草酮懸浮劑中加入4 種噴霧助劑，通過分析不同處理的藥液在雜草葉面靜態(tài)、動態(tài)接觸角及其對雜草葉片濕潤性能影響，最終篩選出綜合效果最好的助劑是GYT1602，其次是GY-Tmax 和乙基和甲基化植物油?；诖朔椒?，本研究通過測定4 種噴霧助劑在不同添加濃度下藥液的表面張力及在水稻葉面上接觸角的變化，發(fā)現添加卵磷脂的效果不佳，而添加有機硅、TM-10 和SY-6535 的效果顯著。由此可見，這3 種助劑能增進解淀粉芽胞桿菌Lx-11 藥液在水稻葉片的潤濕、滲透和黏附性能。顧中言等[26]測得水稻葉片的臨界表面張力為36～38 mN/cm，添加助劑后當藥液的表面張力低于水稻葉片的臨界表面張力時，藥液才能有效潤濕附著在水稻葉片上。本研究發(fā)現，隨著助劑添加量的增加，藥液的表面張力值趨于平緩，同時藥液在水稻葉片表面的接觸角隨著助劑添加量的增加而逐漸降低，但藥液的表面張力與接觸角兩者間關聯度不高。

研究顯示，藥液在植物表面的潤濕性能受多方面因素影響，不僅與表面張力有關，而且與植物表面蠟質、葉片形態(tài)和葉片趨性也緊密相關[25,27]。進一步將篩選出的3 種噴霧助劑對水稻幼苗進行安全性評價，發(fā)現SY-6535、TM-10 和有機硅在各自CMC 值200%濃度下噴施，水稻幼苗的生長與CK 相比均無顯著性差異，未見藥害現象發(fā)生，可見這3 種助劑在合適的使用濃度范圍對水稻生長是安全的。綜上所述，本研究所選的表面活性劑類助劑與解淀粉芽胞桿菌Lx-11 生物相容性高，能有效降低藥液表面張力與接觸角，且對水稻幼苗生長無影響。

楊石有等[28]添加助劑JFC-2 后，使用不同劑量螺螨酯懸浮劑對木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus的防治效果增效比范圍為10.3%～24.6%，添加助劑PBO 對噠螨靈乳油防治效果的增效比范圍為12.1%～28.9%，兩種助劑添加后均可有效減少化學農藥使用量。潘文軒等[29]將質量分數為0.2%的激健和0.1% 的GY-T1602 加入40%丁香 · 戊唑醇懸浮劑中，發(fā)現添加助劑后藥液對玉米大斑病的防治效果分別提升17.72%和14.86%。白微微等[30]發(fā)現，在22%氟啶蟲胺腈SC 中添加助劑ND-800、G2801、N380 和倍達通后對棉蚜的防治效果均有不同程度提高，其中添加ND-800 處理在0.60 g/hm2時對棉蚜藥后7 d 的防治效果在90%以上，顯著高于不添加助劑的防治效果。本研究選取噴霧助劑TM-10 與SY-6535 進行盆栽試驗，發(fā)現添加TM-10 和SY-6535 后藥液的防治效果分別提高了14.28%和12.02%，可見噴霧助劑對微生物殺菌劑的增效比與對化學農藥相當。葉面定殖試驗結果表明，添加噴霧助劑后，解淀粉芽胞桿菌Lx-11在葉面上定殖量顯著高于未添加助劑處理，這也可能是藥液防治效果提高的重要原因之一。

目前，噴霧助劑在除草劑方面應用較多[31]，在殺菌劑上的應用還比較少。將噴霧助劑應用于微生物農藥時，需要考慮助劑對生物活體的影響，應該選擇不會對微生物造成傷害，易被植物吸收且無藥害，同時藥液中的活體生物個體具有良好的分散性及懸浮性，對環(huán)境的適應性好等，從而提高微生物制劑對病害的防治效果，達到減量增效的目的。