彭怡霖, 金雅琪, 崔永亮, 張耀海*,

(1.西南大學(xué)/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 柑桔研究所，重慶 400712；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)測(cè)試中心，重慶 400712；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑橘類果品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400712；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，重慶 400712；5.國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712)

農(nóng)藥在作物生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量、害蟲(chóng)防治等方面效果顯著，但一些農(nóng)藥因?qū)Νh(huán)境和人類產(chǎn)生不利影響而被禁止或限制使用[1]。農(nóng)藥的禁限用一般不是全球性的，通常被限制于一個(gè)國(guó)家或一些國(guó)家[2]。目前我國(guó)禁用的農(nóng)藥有46 種，限制使用的農(nóng)藥有20 種[3]，被禁限用的主要原因包括致癌、致畸、劇毒或高殘留、環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)等，見(jiàn)表1 和表2。

表1 我國(guó)46 種禁用農(nóng)藥[3]Table 1 The 46 banned pesticides in China[3]

表2 我國(guó)20 種限制使用農(nóng)藥[3]Table 2 The 20 restricted pesticides in China[3]

有機(jī)氯類農(nóng)藥曾經(jīng)是使用量最大的殺蟲(chóng)劑，被廣泛應(yīng)用于世界各國(guó)，但其大多不易揮發(fā)、脂溶性強(qiáng)、在生物體內(nèi)代謝緩慢、可通過(guò)生物鏈富集和食物鏈傳遞而危害生物，因此被逐漸禁止使用。例如，在世界范圍內(nèi)造成了持久污染的滴滴涕和六六六；在動(dòng)植物中，艾氏劑可代謝為狄氏劑[4]，從而更耐生物降解；三氯殺螨醇對(duì)野生動(dòng)物和人類有雌激素效應(yīng)等[5]。目前，我國(guó)有機(jī)氯類禁止使用的農(nóng)藥有滴滴涕、三氯殺螨醇、艾氏劑、狄氏劑、硫丹、六六六、毒殺芬、二氯溴丙烷和林丹9 種，尚無(wú)限制使用的農(nóng)藥[3]。這些農(nóng)藥理化性質(zhì)穩(wěn)定，大多可以轉(zhuǎn)換并在環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間存在，較難降解，有極高的生物積累能力和毒性作用，極易通過(guò)食物鏈在生物體組織內(nèi)富集。有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥能夠引起神經(jīng)毒性、生殖毒性以及會(huì)致畸、致癌和致突變等[6]，即使?jié)舛群艿蜁r(shí)也會(huì)損害生命健康，并導(dǎo)致激素依賴性癌癥，因而有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥給人類、動(dòng)植物以及生態(tài)環(huán)境造成的影響不容忽視[7]。雖然一些有機(jī)氯農(nóng)藥已經(jīng)被禁止或限制生產(chǎn)長(zhǎng)達(dá)40 多年，但由于20 世紀(jì)此類農(nóng)藥的大量生產(chǎn)和使用，致使當(dāng)前在大氣、土壤、水體等環(huán)境介質(zhì)中仍能檢出其殘留，甚至食品中關(guān)于有機(jī)氯禁限用農(nóng)藥殘留超標(biāo)也時(shí)有報(bào)道[8]，如滴滴涕在停止使用40 多年后還能在環(huán)境和食物中檢出[9]。

受食品安全問(wèn)題影響，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家提高了食品質(zhì)量安全進(jìn)口門檻，并針對(duì)有機(jī)氯等多類禁限用農(nóng)藥殘留問(wèn)題對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品亮起了紅燈。因此，嚴(yán)格制定有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥相關(guān)的法律法規(guī)和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，建立有效且有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的殘留檢測(cè)方法，是十分有必要的。目前，有關(guān)有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要集中在儀器分析方面[10-11]，但儀器分析存在一定的局限性，例如儀器昂貴、操作復(fù)雜、不適合大批量樣品快速測(cè)定等，而免疫分析方法具有低成本、易操作、靈敏度高、樣品容量大、適合現(xiàn)場(chǎng)快檢等優(yōu)勢(shì)，在有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。目前還沒(méi)有關(guān)于有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥免疫分析方面的綜述。

1 有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥抗原的合成和抗體的制備

有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥的分子質(zhì)量小于1000 Da，屬于小分子物質(zhì)。小分子物質(zhì)能與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合，但不能單獨(dú)激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該小分子物質(zhì)的抗體，即它只有反應(yīng)原性，不具免疫原性，因此需要與大分子物質(zhì)結(jié)合成為完全抗原。小分子需要在保留其特殊結(jié)構(gòu)的前提下，對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)?shù)匦揎椇透脑?，設(shè)計(jì)合成出半抗原[12]。半抗原再與蛋白等大分子載體偶聯(lián)形成抗原決定簇，進(jìn)而可以刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。常用的偶聯(lián)蛋白包括牛血清白蛋白 (bovine serum albumin,BSA)、卵清蛋白 (ovalbumin, OVA) 以及鑰孔血藍(lán)蛋白 (keyhole limpet hemocyanin, KLH) 等。

目前已制備出抗體的有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥包括硫丹[13-14,25-26]、狄氏劑[15,23]、三氯殺螨醇[16-18,24]、滴滴涕[19-22]以及艾氏劑[23]，而有關(guān)六六六、毒殺芬、二氯溴丙烷和林丹抗體的制備尚未見(jiàn)報(bào)道。表3列出了有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥半抗原設(shè)計(jì)現(xiàn)狀。

表3 有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥半抗原設(shè)計(jì)現(xiàn)狀Table 3 Present situation of hapten design for banned and restricted organochlorine pesticides

續(xù)表3Table 3 (Continued)

針對(duì)以環(huán)戊二烯為骨架的有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥艾氏劑、狄氏劑和硫丹，設(shè)計(jì)半抗原時(shí)一般需保留其六氯環(huán)戊二烯特異性結(jié)構(gòu)且保證充分暴露，在非特異性結(jié)構(gòu)處引入羧基、氨基或者羥基等易與大分子蛋白質(zhì)反應(yīng)的基團(tuán)，有利于提高機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體幾率。張彩芹[13]選擇與硫丹具有相似結(jié)構(gòu)的硫丹醇為原料，采用琥珀酸酐法將其衍生化后引入羧基，再采用活潑酯法與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備出免疫原和包被原，并通過(guò)免疫小鼠制備出了硫丹的單克隆抗體。Manclús 等[14]通過(guò)六氯環(huán)戊二烯和特定烯烴的Diels-Alder 加成反應(yīng)，將烯烴末端引入一個(gè)用于蛋白質(zhì)偶聯(lián)的羧基，設(shè)計(jì)并合成了一種用于檢測(cè)有機(jī)氯農(nóng)藥環(huán)二烯基團(tuán)的半抗原。此后，Kataoka 等[15]用該半抗原通過(guò)羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 活潑酯法偶聯(lián)蛋白后免疫小鼠獲得3 種單克隆抗體，可以定量測(cè)定狄氏劑。

針對(duì)以苯為骨架的有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥三氯殺螨醇和DDT，設(shè)計(jì)半抗原時(shí)主要有兩種思路：一種是以連接兩個(gè)芳環(huán)的碳原子作為衍生位點(diǎn)，引入具有活性基團(tuán)的連接臂；另一種是在苯環(huán)上引入具有一定間隔臂的活性基團(tuán)。Liu 等[16]在三氯殺螨醇連接兩個(gè)芳環(huán)的碳原子上的羥基端引入羧基，然后通過(guò)羧基與載體蛋白偶聯(lián)，該方法雖然簡(jiǎn)單易行，但阻擋了三氯殺螨醇特征結(jié)構(gòu)的暴露，導(dǎo)致得到的抗體特異性低，甚至對(duì)特征部位不識(shí)別。Liu 等[16]和Hongsibsong 等[17]通對(duì)三氯殺螨醇中的 -CCl3基團(tuán)進(jìn)行改造，設(shè)計(jì)并合成了不含有 -CCl3基團(tuán)的半抗原，其也能產(chǎn)生識(shí)別三氯殺螨醇的抗體。楊琳芬等[18]在離三氯殺螨醇的特征結(jié)構(gòu)較遠(yuǎn)處的苯環(huán)上引入羧基，制備得到的半抗原最大程度地暴露出三氯殺螨醇獨(dú)有的結(jié)構(gòu)，為制備特異性強(qiáng)、靈敏度高的三氯殺螨醇抗體奠定了基礎(chǔ)。Abad 等[19]利用上述兩種思路制備了5 種DDT 半抗原，其中通過(guò)苯環(huán)衍生的半抗原所制備的免疫原，既能篩選得到特異性針對(duì)DDT 的單克隆抗體，又能篩選得到識(shí)別DDT 及其類似物的廣譜性單克隆抗體。

目前，針對(duì)DDT、三氯殺螨醇和硫丹已經(jīng)制備出了多種半抗原，而從制備出的抗體效果來(lái)看，只有盡量保持了目標(biāo)分子的特征結(jié)構(gòu)，并具有一定長(zhǎng)度間隔臂的半抗原，所制備出的抗體才能具有高的靈敏度和特異性。

2 有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥抗體的應(yīng)用

檢測(cè)有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥的免疫分析方法主要包括酶聯(lián)免疫分析法、免疫層析試紙條法、化學(xué)發(fā)光法、熒光免疫分析法和免疫傳感器等。

2.1 酶聯(lián)免疫分析法

酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）是各種免疫分析方法中最通用的一種，通過(guò)被酶標(biāo)記的抗原或抗體檢測(cè)抗原抗體相互作用產(chǎn)生的復(fù)合物，其中酶的催化對(duì)底物的顏色變化具有放大作用，使抗原抗體的相互作用可視化[27]。禁限用農(nóng)藥屬于小分子化合物，檢測(cè)時(shí)主要采用的是間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法 (indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay, icELISA)。

董玉華等[28]制備了抗DDT 的多克隆抗體，并采用icELISA 方法測(cè)定了海水和海洋貝類樣品中的DDT 及其主要代謝產(chǎn)物的含量，DDT 的檢出限為25 ng/mL，其在貝類樣品中的回收率為94%～100%之間，在海水樣品中的回收率為88%。丁園等[29]制備了DDT 和硫丹的單克隆抗體并分別建立了其icELISA。結(jié)果表明，其對(duì)DDT和硫丹的IC50值分別為10.72 ng/mL 和9.69 ng/mL，檢出限分別為1.85 ng/mL 和2.19 ng/mL。利用該方法測(cè)定稻田水、土壤、蘋果和香蕉樣品中DDT 和硫丹的殘留量，其平均添加回收率分別為71%～93%和74%～97%，檢測(cè)結(jié)果與采用氣相色譜 (GC) 以及高效液相色譜 (HPLC) 分析的結(jié)果相一致。楊星星等[22]制備了新型抗DDT 的單克隆抗體并建立了其icELISA，方法的 IC50值為61.1 ng/mL，線性范圍 (IC20～I(xiàn)C80) 為6.6～521.8 ng/mL。

Hirano 等[21]根據(jù)制備出的抗DDT 多克隆抗體建立了直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法 (direct competitive enzyme linked immunosorbent assay, dcELISA)，該方法的定量限為0.41 ng/mL，檢出限為0.137 ng/mL。Wigfield 等[30]開(kāi)發(fā)了蘋果、番茄和生菜中硫丹、狄試劑等有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的ELISA 免疫檢測(cè)試劑盒，檢出限為0.01～0.03 mg/L。張駿等[31]制備出了抗硫丹的多克隆抗體并建立了其dcELISA，硫丹在葡萄、胡蘿卜、菠菜和茶葉中的平均添加回收率為83%～112%，與GC 結(jié)果均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。Wang 等[26]開(kāi)發(fā)出兩種用于檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中硫丹的dcELISA：一種是基于微孔板的實(shí)驗(yàn)室測(cè)定法，另一種是基于聚苯乙烯管的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定法。微孔板格式的檢出限為 (0.8 ± 0.1) g/kg，管格式的檢出限為 (1.6 ± 0.2) g/kg。硫丹在葡萄、胡蘿卜、菠菜和煙草中的平均添加回收率為76%～112%，該結(jié)果與GC 分析的結(jié)果一致。

盛相國(guó)[32]通過(guò)制備出的抗三氯殺螨醇單克隆抗體建立icELISA，方法IC50值為1.38 ng/mL，在水樣中的添加回收率為90%～108%。Smith 等[23]根據(jù)制備出的多克隆抗體建立了檢測(cè)牛奶中艾氏劑和狄氏劑的間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA (indirect noncompetitive enzyme linked immunosorbent assay,incELISA)，檢測(cè)范圍為1～5 μg/mL。Kataoka 等[15]篩選出3 種新的單克隆抗體并建立其icELISA，分別定量測(cè)定狄氏劑和七氯混合物中狄氏劑和七氯的含量，發(fā)現(xiàn)單抗DrA-04 對(duì)狄氏劑具有較高的反應(yīng)性，對(duì)七氯的交叉反應(yīng)性約為20%，添加回收率為88%～125%。

酶聯(lián)免疫分析法已被證明是一種能及時(shí)分析大量樣本的有效方法，作為免疫分析方法中最基礎(chǔ)、應(yīng)用最廣泛的方法，同時(shí)也存在靈敏度不夠高、過(guò)程耗時(shí)、易受自身抗體干擾而產(chǎn)生假陽(yáng)性等缺點(diǎn)。因此，今后的研究應(yīng)著眼于：合理制備抗原，篩選高靈敏度和特異性抗體；開(kāi)發(fā)穩(wěn)定、靈敏的酶標(biāo)記；構(gòu)建多信號(hào)的識(shí)別體系，解決單信號(hào)偶然誤差導(dǎo)致假陽(yáng)性/陰性結(jié)果的問(wèn)題；結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)、表面增強(qiáng)拉曼散射、電化學(xué)和光熱效應(yīng)等新技術(shù)來(lái)提高酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)農(nóng)藥的性能。

2.2 免疫層析試紙條法

免疫層析試紙條 (immunochromatographic test strip, ITS) 是以膜為固相，基于吸水墊的毛細(xì)管虹吸效應(yīng)將抗原抗體特異性識(shí)別應(yīng)用于試紙條上的免疫技術(shù)，也稱為橫向流動(dòng)免疫分析 (lateral flow immunoassays, LFIA)[33]。

Liu 等[16]基于抗三氯殺螨醇的單克隆抗體制備了用于檢測(cè)水果和蔬菜中三氯殺螨醇?xì)埩舻哪z體金免疫層析試紙條，檢出限為3.142 ng/mL。采用該方法用肉眼檢測(cè)蘋果和黃瓜樣品中三氯殺螨醇的可見(jiàn)檢出限為50 ng/g，截止值為500 ng/g。萬(wàn)宇平等[34]研制出一種能夠檢測(cè)蔬菜、水果、飼料和牛奶中DDT 含量的膠體金免疫層析試紙條，檢出限為5 μg/kg，檢測(cè)時(shí)間為15 min，假陽(yáng)性率和假陰性率均為零，可用于基層實(shí)驗(yàn)室的大批量樣本檢測(cè)。楊琳芬等[18]建立了檢測(cè)水果中三氯殺螨醇?xì)埩舻哪z體金免疫層析方法，檢出限為1.0 mg/kg，重復(fù)性較好，檢測(cè)速度快，從制樣到得出結(jié)果僅需15 min。周嘉明等[24]開(kāi)發(fā)了一種膠體金免疫層析試紙條，對(duì)茶葉中三氯殺螨醇檢出限為0.2 mg/kg，檢測(cè)時(shí)間8 min。Kranthi 等[35]基于多克隆抗體開(kāi)發(fā)了可用于檢測(cè)硫丹和擬除蟲(chóng)菊酯的LFIA 試劑盒，與硫丹競(jìng)爭(zhēng)抑制IC99值為2378 μg/L。周興華等[36]基于抗硫丹單克隆抗體開(kāi)發(fā)了一種快速檢測(cè)硫丹的膠體金免疫層析試紙條，檢出限為40 ng/g。

隨著研究的深入，免疫層析試紙條結(jié)合金納米顆粒 (AuNPs) 和磁納米顆粒 (MNP) 等材料已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，它們的結(jié)合可以顯著提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。Lisa 等[37]建立了以AuNPs 為基礎(chǔ)的試紙競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法，用于DDT 的納米級(jí)檢測(cè)，DDT 顯色強(qiáng)度與DDT 濃度成反比。在優(yōu)化條件下，DDT 的檢出限為27 ng/mL，在葡萄、芒果汁、牛奶和花椰菜中的添加回收率為87%～94%。

LFIA 是免疫分析方法中用于廣泛篩查和現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)篩查最理想的檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)單、快速、攜帶方便、容易投入大批量生產(chǎn)、貨架期穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。但在實(shí)際檢測(cè)中有一定的局限性：檢測(cè)靈敏度有限、無(wú)法精確界定和量化；通常只能檢出一種靶標(biāo)化合物，僅適用于對(duì)樣品的初篩；在實(shí)際操作中較易出現(xiàn)假陽(yáng)性等。因此，今后的研究應(yīng)著眼于：提高LFIA 的檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)免疫定量分析；開(kāi)發(fā)多殘留免疫層析檢測(cè)系統(tǒng)；結(jié)合其他方法或利用信號(hào)放大系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)多信號(hào)識(shí)別，提高準(zhǔn)確性；將快速檢測(cè)與便攜式記錄設(shè)備相結(jié)合等。

2.3 化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法 (chemiluminescence enzyme-linked immunosorbent assay, CL ELISA) 是將化學(xué)發(fā)光信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)與特異性的免疫分析法相結(jié)合，通過(guò)催化發(fā)光底物產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)?；诨瘜W(xué)發(fā)光的免疫分析方法由于具有信號(hào)增強(qiáng)作用，其檢測(cè)靈敏度優(yōu)于酶聯(lián)免疫分析法，醫(yī)學(xué)檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用，且該方法對(duì)小分子分析物的檢測(cè)也非常靈敏，已成為農(nóng)藥檢測(cè)中的一種常用工具[38]。

Baker 等[39]基于化學(xué)發(fā)光法研制出DDT 檢測(cè)簡(jiǎn)易浸出棒，可用于農(nóng)業(yè)和其他來(lái)源DDT 的靈敏檢測(cè)。該方法的檢出限為0.05 ng/mL，在葡萄、芒果汁、牛奶和花椰菜中的添加回收率為81%～96%，與GC 法分析的結(jié)果一致。該方法還可以在沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室或設(shè)備較差的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。Deepak 等[40]基于制備出的抗硫丹雞卵黃抗體 (IgY) 建立了CL ELISA 分析方法，并將其與比色法進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CL ELISA 分析方法的靈敏度高于比色法，α-、β-硫丹在14 種食品樣品中的平均添加回收率為81%～96%，檢出限分別為100 μg/mL 和5 fg/mL。

CL ELISA 的研究和應(yīng)用在包括農(nóng)藥殘留在內(nèi)的多個(gè)分析領(lǐng)域越來(lái)越受歡迎，今后可以通過(guò)改進(jìn)化學(xué)增強(qiáng)劑和發(fā)光劑、開(kāi)發(fā)新型催化劑來(lái)優(yōu)化化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)；并聯(lián)合其他技術(shù)，如分子印跡技術(shù)等提高檢測(cè)的特異性和靈敏度，實(shí)現(xiàn)多殘留分析或自動(dòng)化檢測(cè)等。

2.4 熒光免疫分析法

熒光免疫分析法 (fluorescence immunoassay,FIA) 是在抗原抗體特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)上，將高靈敏度的熒光信號(hào)用于抗原或抗體的分析檢測(cè)。目前，在禁限用農(nóng)藥殘留的檢測(cè)中常用的熒光標(biāo)記物有熒光素、量子點(diǎn)和熒光納米顆粒等，新型的熒光材料和熒光探針也不斷被開(kāi)發(fā)和應(yīng)用于免疫分析[41]。常與LFIA 結(jié)合來(lái)改進(jìn)信號(hào)讀出方式。

Pan 等[42]通過(guò)靜電力成功構(gòu)建了一種基于谷胱甘肽包封的Au-Ag 雙金屬納米簇 (Au-Ag NCs)和聚乙烯亞胺修飾的金納米顆粒 (PEI-Au NPs) 的雙模型比色/熒光免疫探針，并應(yīng)用于icELISA 和LFIA 檢測(cè)三氯殺螨醇。在icELISA 方法中，熒光信號(hào)的引入顯著提高了檢測(cè)的靈敏度，檢出限可達(dá)到0.62 ng/mL。

FIA 被認(rèn)為是一種能在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)不同農(nóng)藥的可靠、穩(wěn)定的篩選方法，具有靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、樣品干擾少、信號(hào)強(qiáng)度大、適合于自動(dòng)檢測(cè)、可實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)等特點(diǎn)。但也有一定的局限性，樣品制備步驟繁瑣，若樣品著色會(huì)干擾最終的熒光發(fā)射；信號(hào)放大潛力和穩(wěn)定性有待提高；少數(shù)熒光染液具有毒性等。因此，今后的研究應(yīng)著眼于：選擇具有合適發(fā)射峰、低背景信號(hào)、長(zhǎng)熒光壽命和高量子產(chǎn)率的熒光標(biāo)記物，如鑭系螯合物等；引入兩種或兩種以上的標(biāo)記物，改進(jìn)標(biāo)記技術(shù)和簡(jiǎn)化分離工藝；開(kāi)發(fā)穩(wěn)定性好、低毒、靈敏度高的熒光染料用于農(nóng)藥檢測(cè)。

2.5 免疫傳感器

免疫傳感器 (immunosensor) 是一種將免疫檢測(cè)技術(shù)和傳感技術(shù)相結(jié)合的免疫分析技術(shù)。免疫傳感器基于抗體的敏感和特異性作為傳感元件，將抗原與抗體的結(jié)合轉(zhuǎn)換為可讀的信號(hào)，從而達(dá)到識(shí)別和捕獲目標(biāo)分析物的目的[43]。借助傳感器信號(hào)放大的作用，免疫分析的靈敏度和特異性也隨之提高。免疫傳感器正向著便攜化、自動(dòng)化、省時(shí)化、可重復(fù)使用以及能實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)的方向發(fā)展。

Cervera-Chiner 等[44]研制了基于高頻石英晶體微天平 (HFF-QCM) 的壓電免疫傳感器，用于蜂蜜中DDT 的檢測(cè)，檢出限為0.24 μg/L，在蜂蜜樣品中檢出限為24 μg/kg，添加回收率為94%～130%。Alvarez 等[45]開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)測(cè)量由不同表面應(yīng)力產(chǎn)生的微懸臂梁的納米級(jí)彎曲來(lái)檢測(cè)DDT 的方法，用巰基自組裝單分子膜將DDT 與牛血清白蛋白 (BSA) 的偶聯(lián)物共價(jià)固定在懸臂的鍍金一側(cè)，然后將懸臂暴露于單克隆抗體和DDT 的混合溶液中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，最后通過(guò)測(cè)量由表面應(yīng)力產(chǎn)生的微懸臂梁的納米級(jí)彎曲改變測(cè)定樣品中DDT的含量。Liu 等[46]建立了檢測(cè)水中硫丹的電化學(xué)免疫傳感器，在0.01～20 ng/mL 范圍內(nèi)電流與硫丹濃度之間存在線性關(guān)系，檢出限為0.01 ng/mL，在3 種環(huán)境水樣中的添加回收率分別為79%、85%和93%。

免疫傳感器作為新技術(shù)在檢測(cè)應(yīng)用中受到廣泛關(guān)注, 具有廣闊的應(yīng)用前景。相比于其他免疫分析方法具有更高的靈敏度、更強(qiáng)的特異性、信號(hào)強(qiáng)度大、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)。但在應(yīng)用時(shí)也存在背景干擾大、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差、讀取數(shù)據(jù)時(shí)需要借助于大型儀器等不足之處。因此，今后的研究應(yīng)著眼于：結(jié)合適配體等新技術(shù)，取代傳統(tǒng)抗原抗體特異性結(jié)合的模式；結(jié)合納米材料 (如納米金、量子點(diǎn)和碳材料等) 用于增加抗體表面修飾的信號(hào)探針數(shù)量，從而放大信號(hào)和提高靈敏度；將智能手機(jī)和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)等人工智能技術(shù)集成到免疫傳感器中，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)等。

有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥抗體的應(yīng)用現(xiàn)狀見(jiàn)表4。

表4 有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥抗體的應(yīng)用現(xiàn)狀Table 4 Present situation of antibody application for banned and restricted organochlorine pesticides

續(xù)表4Table 4 (Continued)

3 結(jié)論與展望

做好食品中有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，對(duì)于保障食品安全、打破食品出口技術(shù)壁壘具有十分重要的作用。隨著免疫分析技術(shù)的發(fā)展，免疫分析方法在有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥檢測(cè)方面的應(yīng)用不斷得到擴(kuò)展，三氯殺螨醇等免疫檢測(cè)方法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化，極大提高了禁限用農(nóng)藥篩查的效率。表5 比較了有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥免疫分析方法的特點(diǎn)及適用范圍。

表5 有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥免疫分析方法的特點(diǎn)及適用范圍Table 5 Characteristics and application scope of banned and restricted organochlorine pesticides immunoassay

然而，有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥免疫分析技術(shù)與其他農(nóng)藥免疫檢測(cè)方法一樣，在半抗原結(jié)構(gòu)的合理性，抗體的靈敏度、特異性以及穩(wěn)定性，檢測(cè)方法的快速、便捷、直觀以及重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度等方面還存在著一些局限性和阻礙。

在半抗原設(shè)計(jì)上，有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥結(jié)構(gòu)相似性極高，容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，這種交叉反應(yīng)既有優(yōu)點(diǎn)也有缺陷。優(yōu)點(diǎn)是可以利用交叉反應(yīng)，通過(guò)一種抗體對(duì)大多有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥進(jìn)行同時(shí)篩查，但交叉反應(yīng)的缺點(diǎn)也很明顯，利用一種抗體無(wú)法具體測(cè)定樣品中某一種有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥。這就要求針對(duì)單一農(nóng)藥設(shè)計(jì)半抗原時(shí)，應(yīng)在保留特征結(jié)構(gòu)的同時(shí)又突出其與其他農(nóng)藥結(jié)構(gòu)的不同來(lái)解決交叉反應(yīng)的問(wèn)題。

在抗體制備方面，有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥抗體主要是兔多克隆抗體和鼠單克隆抗體，還有少數(shù)雞卵黃免疫球蛋白。這些傳統(tǒng)的抗體制備方法存在制備周期長(zhǎng)、抗體穩(wěn)定性差、批次間差異大等缺點(diǎn)，而近年來(lái)基因工程抗體、納米抗體和仿生抗體等新型抗體制備技術(shù)發(fā)展迅速，具有很好的應(yīng)用前景，可以作為有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥抗體研究的一個(gè)方向。

在有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥抗體的應(yīng)用上，新型免疫分析方法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)免疫分析方法的諸多不足但也存在局限性。例如，免疫層析試紙條法的靈敏度和精確度有待進(jìn)一步提高；免疫傳感器的背景干擾、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性有待解決；化學(xué)發(fā)光免疫分析法所需測(cè)定儀器體積較大，發(fā)光的峰值衰減快、本底較高、存在背景干擾；熒光免疫分析法需要特殊的設(shè)備對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)等。

因此，未來(lái)有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥免疫分析方法的研究應(yīng)集中在以下幾個(gè)方面：

1) 設(shè)計(jì)新型有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥半抗原，制備出特異性好、靈敏度高的抗體。

2) 基于納米抗體、基因工程抗體、仿生抗體等技術(shù)，提高有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥抗體的穩(wěn)定性。

3) 結(jié)合納米材料、傳感器等新材料和方法，開(kāi)發(fā)靈敏度高、準(zhǔn)確性好的有機(jī)氯類禁限用農(nóng)藥多殘留的免疫檢測(cè)方法，如生物條形碼檢測(cè)技術(shù)。

4) 基于微型化技術(shù)，將檢測(cè)設(shè)備小型化、便攜化，在降低檢測(cè)成本的同時(shí)，推進(jìn)小型化設(shè)備的商業(yè)化。

5) 將免疫檢測(cè)方法與云計(jì)算、大數(shù)據(jù)、人工智能等相關(guān)的新興技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品全產(chǎn)業(yè)鏈中禁限用農(nóng)藥的智能化和數(shù)字化監(jiān)測(cè)。