宋修仕, 高 靜, 周明國

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，南京 210995)

0 引言

RNA 干擾 (RNA interference，縮寫為RNAi)是指由RNA (細(xì)胞內(nèi)源或外源) 誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是短的反義RNA 通過阻礙與其有互補(bǔ)序列基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯來抑制基因的表達(dá)。近年來，基于RNAi 機(jī)制的有害生物防治策略發(fā)展迅速，用于防治有害生物的RNA 分子制劑被稱為核酸農(nóng)藥。相比于傳統(tǒng)的小分子農(nóng)藥，核酸農(nóng)藥靶標(biāo)特異性強(qiáng)，無殘留，且開發(fā)成本遠(yuǎn)低于化學(xué)農(nóng)藥，符合當(dāng)今社會對于環(huán)境友好型農(nóng)藥的要求[1-2]。2018 年，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了第1 個基于RNAi 的藥物——ONPATTRO，該藥物可治療伴有多發(fā)性神經(jīng)疾病的遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性 (hATTR)[3]，這標(biāo)志著RNAi 技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)入一個新時代。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，首個在美國國家環(huán)境保護(hù)署 (EPA) 獲批的核酸農(nóng)藥產(chǎn)品是表達(dá)DvSnf7 雙鏈RNA 的轉(zhuǎn)基因玉米，用以防治西方玉米根蟲Diabrotica virgifera virgiferaLeConte(western corn rootworm, WCR)，該產(chǎn)品計劃于2024 上市 (https://traits.bayer.com/corn/Pages/SmartStax-PRO.aspx)。近期，拜耳集團(tuán)采用RNAi 技術(shù)生產(chǎn)的VT4PRO?玉米也獲得了EPA的商業(yè)登記，最早將于2024 年在美國上市。雖然RNAi 防治有害生物的技術(shù)正處于商業(yè)開發(fā)的熱點(diǎn)階段，但若實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模應(yīng)用還需要解決一些阻礙，例如RNA 遞送至靶細(xì)胞的效率問題、靶標(biāo)基因的沉默效率問題、劑量限制性毒性和干擾效率不足以及RNA 分子的穩(wěn)定性和持效性等[4-7]。就防治病原微生物的核酸殺菌劑而言，雖然已有文章報道在實(shí)驗(yàn)室條件下，體外或體內(nèi)應(yīng)用合成的長雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 或小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA) 可以下調(diào)微生物中靶標(biāo)必須基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)防控卵菌、真菌和病毒病原體[8-11]，但是其防治效果與穩(wěn)定性方面表現(xiàn)得較為復(fù)雜。本文擬從RNAi 的發(fā)展歷程中探尋那些改變核酸殺菌劑發(fā)展方向的重要事件，從理論與技術(shù)角度分析核酸殺菌劑目前存在的問題與障礙，通過比較化學(xué)殺菌劑與核酸殺菌劑的優(yōu)缺點(diǎn)闡述核酸殺菌劑的發(fā)展對化學(xué)殺菌劑市場的影響。

1 RNAi 研究的發(fā)展歷程

R N A i 現(xiàn)象是F i r e 等在對秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans的研究中發(fā)現(xiàn)并揭示的[12]。該生物現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)解釋了之前在植物[13-14]、真菌[15]和動物[16]中觀察到的令人困惑的基因沉默現(xiàn)象。隨后，RNAi 現(xiàn)象被證實(shí)在多種生物中廣泛存在，但是不同物種間RNAi 核心元件的起源和生物合成存在較大差異，這引發(fā)了科研人員的研究興趣[17]。目前人們普遍認(rèn)為19～30 nt 的非編碼小RNA (small RNAs, sRNAs) 在RNAi 過程中發(fā)揮著重要作用。sRNAs 根據(jù)來源、結(jié)構(gòu)和生物作用可分為3 類：小干擾RNAs (siRNAs)、微小RNAs (microRNAs，miRNAs) 和piwi RNAs (piwi-interacting RNAs,piRNAs)。大多數(shù)真菌的sRNAs 為siRNAs。生物體內(nèi)的RNAi 過程大致可分為起始、效應(yīng)和級聯(lián)放大3 部分[18]。2001 年，科研工作者發(fā)現(xiàn)Dicer酶是R N A i 起始步驟的關(guān)鍵酶，D i c e r 將長dsRNA 剪切加工為成熟的siRNA；然后，siRNA單鏈被加載到具有核酸內(nèi)切活性的Argonaute 蛋白上，形成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物 (RNA-induced silencing complex, RISC)。siRNA 與互補(bǔ)的信使RNA(messenger RNA, mRNA) 結(jié)合后，靶標(biāo)mRNA 會被Argonaute 直接剪切或介導(dǎo)RISC 對mRNA 的翻譯抑制[1]。研究者隨后發(fā)現(xiàn)，RNA 依賴性RNA 聚合酶 (RNA-dependent RNA Polymerase,RdRP) 參與次級小RNA 的產(chǎn)生與復(fù)制，進(jìn)一步增強(qiáng)和放大了沉默效應(yīng)。在植物和秀麗隱桿線蟲C.elegans中，RdRP 可在靶RNA 模板上形成合成sRNA 或dsRNA 的擴(kuò)增環(huán)，起到級聯(lián)放大的作用[19]。隨著研究的逐漸深入，RNAi 成為哺乳動物[20]、植物[21]、線蟲[22]、真菌[23]和卵菌[24]基因功能研究的重要工具。RNA 在生物體內(nèi)有效的傳遞與運(yùn)輸是RNAi 應(yīng)用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的前提。大量研究表明，sRNA 可以在相互作用的生物體內(nèi)傳遞 (例如植物-真菌)，進(jìn)而誘導(dǎo)彼此的基因沉默，該機(jī)制被稱為跨界RNA 干擾[25-27]。dsRNA 或sRNA 只有進(jìn)入細(xì)胞中才能發(fā)揮出高效的沉默效率，不同生物對dsRNA 或sRNA 的攝取機(jī)制存在差異。在秀麗隱桿線蟲C.elegans中，dsRNA 的吸收主要是通過SID 跨膜蛋白家族[28-30]。SID-2基因編碼一種跨膜蛋白，通過內(nèi)吞作用十分緩慢地攝取dsRNA，而SID-1基因產(chǎn)物與內(nèi)吞作用無關(guān)，主要參與質(zhì)膜中快速轉(zhuǎn)運(yùn)和通道的形成[31-32]。昆蟲細(xì)胞攝取dsRNA 的機(jī)制現(xiàn)已基本確定為網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞作用[33-35]。棉鈴象鼻蟲Anthonomus grandis中dsRNA 的細(xì)胞攝取與大胞飲作用相關(guān)[36]。到目前為止，雖然有文章報道網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用參與了核盤菌對dsRNA 的攝取[37]，但真菌吸收dsRNA 或sRNA 的具體機(jī)制仍不清楚。這也限制了核酸農(nóng)藥在真菌防控方面的發(fā)展。

RNAi 藥物首先在醫(yī)藥領(lǐng)域得到發(fā)展。2003年，siRNA 首次作為藥物應(yīng)用于哺乳動物，其治療潛力一度成為多家公司的研究熱點(diǎn)[38]。然而，首批siRNAs 臨床試驗(yàn)RNAi 效果不顯著并伴隨不確定的干擾效應(yīng)，試驗(yàn)中也出現(xiàn)了與免疫相關(guān)的毒性，最終以失敗告終；隨后第2 波的臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)應(yīng)用siRNA 納米制劑能對人體產(chǎn)生效果，但是藥效一般，同時表現(xiàn)出明顯的劑量限制性毒性和療效不足的問題[39-40]。鑒于RNAi 藥物的負(fù)面作用，21 世紀(jì)10 年代初大型制藥公司退出了RNAi 藥物研究領(lǐng)域，這對該行業(yè)造成極大的打擊。但是，一些較小的RNAi 藥物公司和科研人員一直堅(jiān)持改進(jìn)siRNA 的遞送、序列選擇、化學(xué)配方和輸送機(jī)制等技術(shù)，并取得了一定的進(jìn)展。2018 年，RNAi 藥物ONPATTRO (patisiran)得到美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 和歐洲藥品管理局 (EMA) 的批準(zhǔn)，該類新siRNA 藥物主要用于治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素淀粉樣變性病[41-42]。最近，F(xiàn)DA 和EMA 批準(zhǔn)吉夫拉里 (Givlaari?) 作為第2 個RNAi 藥物用于治療急性肝卟啉癥 (AHP)成人患者[43-44]。多種適用于肝臟、腎臟和眼部疾病的候選藥物正處于I、II 和III 期臨床試驗(yàn)中[45-46]，RNAi 醫(yī)藥重新成為研究焦點(diǎn)。

基因工程 (genetic engineering, GE) 的迅速發(fā)展使得RNAi 相關(guān)藥品在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中發(fā)展迅速[4,47]，核酸農(nóng)藥應(yīng)運(yùn)而生。針對有害生物的RNAi 技術(shù)可以通過不同的方式實(shí)現(xiàn)，包括通過宿主誘導(dǎo)的基因沉默 (host-induced gene silencing，HIGS)、噴霧誘導(dǎo)的基因沉默 (spray-induced gene silencing，SIGS) 以及病毒誘導(dǎo)的基因沉默 (virus-induced gene silencing，VIGS)[48]。農(nóng)業(yè)領(lǐng)域首個商業(yè)化RNAi 產(chǎn)品是可以表達(dá)dsRNA 的轉(zhuǎn)基因玉米，通過表達(dá)靶向Snf7基因的發(fā)夾dsRNA 來控制西方玉米根蟲[49]。該商品于2017 年獲得EPA 批準(zhǔn)，已經(jīng)以商品名SmartStax Pro 在2022 年上市 (https://traits.bayer.com/corn/Pages/SmartStax-PRO.aspx)。除此之外，一種靶向蛋白酶體亞基β5 編碼基因(PSMB5) 的長鏈dsRNA 生物農(nóng)藥活性成分，名為Ledprona，目前正處在EPA 審查注冊期間 (https://www.federalregister.gov/documents/2021/06/21/2021-12999/pesticide-experimental-use-permit-receipt-ofapplication-comment-request-june-2021)。

2 核酸殺菌劑在植物病害防控中的應(yīng)用與瓶頸

在RNAi 被用于病害防控的最初階段，RNAi對病毒性病害的防控是眾多研究者探究的熱點(diǎn)內(nèi)容[49-50]?？蒲腥藛T分別開發(fā)了4 類基于RNAi 的抗病毒技術(shù)：正義鏈誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默 (S-PTGS)、發(fā)夾RNA 誘導(dǎo)的PTGS (hp-PTGS)、人工miRNA誘導(dǎo)的PTGS (AMIR) 和反式作用siRNA 誘導(dǎo)的PTGS (TAS)[51]。利用上述技術(shù)培育了可以表達(dá)sRNA 的轉(zhuǎn)基因植株，并分別在實(shí)驗(yàn)室和田間條件下進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植物獲得了對病毒的持久抗性[52-54]。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用收購服務(wù) (ISAAA) 網(wǎng)站報道，數(shù)十種使用RNAi 基因工程開發(fā)的抗病毒轉(zhuǎn)基因作物已獲準(zhǔn)商業(yè)發(fā)行(http://www.isaaa.org/)。

在過去10 年中，已有成功應(yīng)用RNAi 控制病原真菌和卵菌的報道[55-61]。2010 年，研究人員首次通過在轉(zhuǎn)基因煙草植株中表達(dá)dsRNA，成功沉默輪枝鐮刀菌Fusarium verticillioides轉(zhuǎn)基因菌株的β-glucuronidase(GUS) 報告基因。隨后，有文章報道，在應(yīng)用HIGS技術(shù)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因小麥、大麥和擬南芥[62]中小麥白粉病菌Blumeria graminis和禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum的侵染速度變慢，采用同樣的方法還可抑制尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum對香蕉的侵染[63]。在疫霉的RNAi 研究中，轉(zhuǎn)基因dsRNA 序列的穩(wěn)定表達(dá)成功沉默了致病疫霉Phytophthora infestans[55,64]和寄生疫霉Phytophthora parasitic[58]的靶基因。但是，也有RNAi 未起作用的報道，在表達(dá)PnPMA1dsRNA的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，HIGS 介導(dǎo)的寄生疫霉沉默未能成功啟動[11]。

由于轉(zhuǎn)基因植株培育時間較長，不需培育轉(zhuǎn)基因植株的噴霧誘導(dǎo)基因沉默 (SIGS) 逐漸步入人們視野。隨后，SIGS 被證明可有效防治禾谷鐮刀菌F.graminearum、灰霉病菌Botrytis cinerea和油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum等。研究發(fā)現(xiàn)，外源噴施dsRNA 對于防治灰霉病菌、菌核病菌、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、黑曲霉Aspergillus niger和大麗輪枝菌Verticillium dahliae效果較好，但對于卵菌 (如致病疫霉) 效果一般[65]。dsRNA 可以通過根或樹干進(jìn)入植物維管系統(tǒng) (木質(zhì)部和韌皮部)[66-67]，但其通過不同植物組織的吸收效率不同。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)殺菌劑生物學(xué)團(tuán)隊(duì)證明了小麥胚芽鞘完整表面較難吸收dsRNA，而創(chuàng)面則能有效吸收dsRNA[9]。

盡管有關(guān)RNAi 技術(shù)的基礎(chǔ)研究熱度不斷提升，但是其大規(guī)模應(yīng)用仍有很多需要克服的難關(guān)。常見的阻礙有脫靶效應(yīng)、RNA 分子的穩(wěn)定性和成本等。本文將著重分析影響RNAi 效率的因素，雖然這些觀點(diǎn)與前人的觀點(diǎn)存在些許差異，但是可以解釋RNAi 殺菌劑商業(yè)化難的原因。由于作用機(jī)制不同，我們將分開討論HIGS 和SIGS 中RNAi 效率影響因素。

首先介紹HIGS 中RNAi 效率的影響因素。HIGS 中，RNA 分子是由轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生的，因此其siRNA 濃度是由植物RNAi 系統(tǒng)相關(guān)酶及dsRNA 的表達(dá)程度決定的。許多因素可以影響植物中dsRNA 的表達(dá)，如啟動子強(qiáng)度、dsRNA 的長度和結(jié)構(gòu)以及植物基因組的特征[4,47]。在大多數(shù)研究中，科研工作者采用組成型強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄dsRNA，并利用內(nèi)含子間隔正義和反義RNA 序列，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA (Hairpin RNA, hpRNA)，以期高效表達(dá)dsRNA[68-69]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，這種傳統(tǒng)的hpRNA 設(shè)計會造成dsRNA 轉(zhuǎn)錄的自沉默，而用胸腺嘧啶替代胞嘧啶可以防止自沉默，且不影響hpRNA 的形成，達(dá)到高效沉默的目的[70]。值得注意的是，不同真核生物的Dicer 蛋白家族在結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和分子功能上表現(xiàn)出明顯的多樣性[71]。不同物種中的Dicer 和DCL (Dicer-like protein) 在RNA 靶標(biāo)偏好、siRNA 產(chǎn)物長度和特定相互作用對象方面也存在差異[72-75]。因此，盡管dsRNA 相同，植物細(xì)胞與真菌細(xì)胞體內(nèi)切割產(chǎn)生的siRNA卻不同[9]。所以，當(dāng)植物產(chǎn)生的siRNA 被真菌吸收并利用真菌Argonaute 蛋白誘導(dǎo)RNA 沉默時，RNAi 效率可能會降低 (圖1)。有報道稱，靶向相同基因的dsRNA 和siRNA 都可以降低基因表達(dá)，但在赤擬谷盜Tribolium castaneumHerbs 中，只有使用dsRNA 才能觀察到RNAi 介導(dǎo)的表型變化[76]。事實(shí)上，高濃度siRNA 并不代表擁有高效率RNAi。這是因?yàn)镠IGS 的觸發(fā)主要決定于siRNA 的吸收濃度[77]。雖然植物可以通過細(xì)胞外囊泡向病原真菌運(yùn)送sRNA[78-79]，但除此之外，真菌中的RNAi效率還會受到siRNA 特性的影響。研究者發(fā)現(xiàn)，由于植物質(zhì)體中不存在RNAi，因此在植物質(zhì)體中表達(dá)dsRNA 可以排除植物RNA 干擾相關(guān)元件對dsRNA 的切割，從而避免與不同物種間RNAi 的差異性，這或許可以解決由siRNA 差異導(dǎo)致的RNAi 效率差的問題[80-82]。除了技術(shù)因素之外，基于HIGS 的轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化還受到國家政策的限制。HIGS 類轉(zhuǎn)基因作物在抗蟲、抗病上存在較大優(yōu)勢，但也存在一些隱患，例如基因漂流、基因污染、抗生素標(biāo)記基因轉(zhuǎn)移等[83-84]。因此，我國對轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化十分謹(jǐn)慎，并制定了相關(guān)轉(zhuǎn)基因法律法規(guī)和管理規(guī)范進(jìn)行風(fēng)險控制[85]。

最新研究表明，SIGS 中RNAi 效率影響因素比HIGS 中更復(fù)雜[86-88]。噴施在植物表面的dsRNA分為直接和間接兩種方式進(jìn)入真菌體內(nèi)：直接途徑為RNA 直接被真菌細(xì)胞吸收；間接途徑為RNA首先被植物細(xì)胞吸收，然后運(yùn)輸?shù)秸婢?xì)胞中。不同途徑吸收的RNA 以不同的機(jī)制發(fā)揮作用，真菌細(xì)胞直接吸收的RNA 直接引發(fā)了真菌RNAi 機(jī)制；而植物細(xì)胞吸收的RNA 先引發(fā)了植物RNAi機(jī)制，進(jìn)而引發(fā)了真菌的RNAi 機(jī)制 (圖1)。如前文所述，噴灑在胚芽鞘完整表面的dsRNA 不能被胚芽鞘吸收，而可能是直接被真菌細(xì)胞吸收。因此，dsRNA 只可在短時間內(nèi)發(fā)揮作用，并不能提高植物的抗病能力。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)殺菌劑生物學(xué)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)亞洲鐮刀菌F.asiaticum中由dsRNA 引發(fā)的RNAi 效應(yīng)僅可持續(xù)約9 h，這是因?yàn)閬喼掮牭毒鸁o法擴(kuò)增產(chǎn)生次級siRNA。siRNA 在生物體內(nèi)的二次擴(kuò)增與RdRP 直接相關(guān)，RdRP 通過將單鏈RNA 轉(zhuǎn)化為dsRNA 或合成siRNA 來進(jìn)一步增強(qiáng)和放大RNAi 效果。迄今為止發(fā)現(xiàn)的所有RdRP都是從一個祖先RdRP 進(jìn)化而來，在植物、真菌和部分動物中發(fā)現(xiàn)了許多同源物[19,89]。在許多后生動物中也發(fā)現(xiàn)了RdRP 的同源物，比如線蟲綱 (秀麗隱桿線蟲)、刺胞動物門 (水螅Hydra)、螯肢動物亞門 (蜱Tick)、半索動物門 (囊舌蟲Acorn worm)、尾索動物亞門 (海鞘Sea squirt)；但在其他類群中，例如扁形動物門 (渦蟲Planaria)、六足亞門 (果蠅Drosophila) 或脊椎動物門 (脊椎動物Vertebrates) 等基因組中卻無發(fā)現(xiàn)[90]。有趣的是，禾谷鐮刀菌F.graminearum中至少存在5 個RdRP[91]，但其siRNA 的二次擴(kuò)增并不充分。此外，dsRNA的遞送效率和穩(wěn)定性同樣影響RNAi 效率，這是因?yàn)閐sRNA 在遞送至靶標(biāo)生物的過程中十分容易受到酶或pH 值等因素的影響而降解。為了解決此類問題，科研人員將核酸序列包埋在特定的材料中，形成核酸-材料復(fù)合體，不僅成功提高了核酸穩(wěn)定性、增加了遞送效率，有些材料還可以起到增效的作用[4]。目前常見的包被系統(tǒng)為脂質(zhì)體[92]、病毒樣顆粒[93]、復(fù)合納米顆粒[94]和生物粘土[95]，根據(jù)待遞送的RNA 類型、靶生物及其攝取機(jī)制選取合適的包被系統(tǒng)。

圖1 影響RNAi 效率的因素Fig.1 Factors affecting RNAi efficiency

從上文中我們不難看出，HIGS 和SIGS 最終的關(guān)鍵步驟均為誘導(dǎo)真菌細(xì)胞的基因沉默。但是，dsRNA 或sRNA 分子進(jìn)入真菌時會被細(xì)胞壁和細(xì)胞膜阻隔。真菌細(xì)胞壁在真菌與環(huán)境的相互作用中發(fā)揮著重要作用。真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，通常由幾丁質(zhì)、β-1,3-和β-1,6-葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質(zhì)組成，不同真菌細(xì)胞壁組成成分差異較大[96]。以釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae為例，甘露糖蛋白是酵母細(xì)胞壁的重要組成成分，決定了細(xì)胞壁的孔隙度，研究表明，在分子自然折疊的情況下，酵母細(xì)胞壁可阻擋大于600 Da的分子進(jìn)入[97]。20-nt siRNA 的分子質(zhì)量約為6569 Da，在自然折疊的情況下，分子粒徑遠(yuǎn)大于細(xì)胞壁的孔隙度。這也就意味著，dsRNA 或sRNA 很難通過正常的細(xì)胞壁表面進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。之前的研究表明，除非使用轉(zhuǎn)化技術(shù)，如原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔、生物方法和沖擊波介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，否則幾乎不可能將遺傳信息 (質(zhì)?；蚧? 運(yùn)輸?shù)秸婢?xì)胞中[98]。但是，這并不意味著sRNA或dsRNA 絕對不能穿過細(xì)胞壁。研究表明，釀酒酵母表面分布有直徑在50～250 nm 之間的孔隙。351 個核苷酸的RNA 平均截面長度為(43.6 ± 4.6) nm，頭部直徑測量為 (17.0 ± 3.6) nm[99]。如此看來，短一些的dsRNA 和sRNA 有可能通過孔隙進(jìn)入真菌細(xì)胞 (圖1)，但是據(jù)我們觀察這個效率極低[9]。

在許多真核生物中，胞吞作用也參與了dsRNA的攝取。最近的研究證實(shí)，核盤菌中dsRNA 的攝取是通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用發(fā)生的[10]。內(nèi)吞作用是生物體內(nèi)重要的生物活動，指的是通過質(zhì)膜的變形運(yùn)動將細(xì)胞外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)的過程。強(qiáng)有力的證據(jù)表明，內(nèi)吞作用在菌絲頂端占主導(dǎo)地位[100]，在快速生長的菌絲中，肌動蛋白斑塊集中在菌絲頂端，形成一個頂端下環(huán)，與分泌為主的尖端空間耦合。因此，快速延伸的菌絲頂端具有更有效的內(nèi)吞作用[100-103]。我們的研究結(jié)果與上述理論一致，Myo5-8dsRNA 誘導(dǎo)的表型出現(xiàn)在亞洲鐮刀菌和禾谷鐮刀菌菌絲頂端[9]。據(jù)報道，RNAi 信號可以在植物不同細(xì)胞間轉(zhuǎn)移[67]，但在禾谷鐮刀菌中，大多數(shù)RNAi 相關(guān)表型仍表現(xiàn)在頂端細(xì)胞中[9]。

除此之外，真菌中還存在其他可以影響RNAi效率的因素。之前的研究表明，將dsRNA 負(fù)載于納米顆粒上可提高其穩(wěn)定性和效果[95]。但是，增強(qiáng)dsRNA 的穩(wěn)定性并不能完全提高RNAi 效率的穩(wěn)定性，這是因?yàn)檫€存在另外可以降低RNAi 效率的復(fù)雜機(jī)制[104]。在這里，我們討論的RNAi 效率的穩(wěn)定性并不是指體外合成的dsRNA 或sRNA分子的穩(wěn)定性，而是體內(nèi)RNA 干擾效率的穩(wěn)定性，即對靶基因的沉默效率穩(wěn)定性。RNAi 效率受多種因素影響，同一物種的不同轉(zhuǎn)錄本及基因型[105]、同一轉(zhuǎn)錄本的不同區(qū)域[9,68,88]，甚至是觀察表型效果的不同時間都有可能觀察到不同的RNAi 效率[88,106]。在精心控制試驗(yàn)變量的條件下，經(jīng)常會得到重復(fù)率低甚至前后矛盾的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，靶標(biāo)mRNA 的表達(dá)調(diào)控、靶標(biāo)mRNA 的二級結(jié)構(gòu)、sRNAs 的數(shù)量與序列特異性，以及dsRNA 效應(yīng)因子等因素都可以影響RNAi 效率。首先，不同的mRNA 在豐度、表達(dá)時間和空間上存在顯著差異。不難想象，如果靶標(biāo)mRNA 表達(dá)高且易變，那么它就不容易被沉默。對鱗翅目昆蟲的RNAi 試驗(yàn)分析顯示，在130 個被測試的基因中，高水平沉默的占38%，低水平沉默的占14%，完全沒有沉默的占48%[107]。其次，基因沉默效率與靶標(biāo)位點(diǎn)局部的mRNA 結(jié)構(gòu)呈負(fù)相關(guān)，該結(jié)構(gòu)可以通過氫鍵 (H-b) 指數(shù) (結(jié)構(gòu)因子的單一參數(shù)) 來表征[108]。這也就解釋了為什么dsRNA 或siRNA的基因沉默效率會因mRNA 的靶向位置而產(chǎn)生巨大的差異。有趣的是，所有關(guān)于dsRNA 位置效應(yīng)的報道都有一個共同點(diǎn)——沒有在dsRNA 同源區(qū)域之外發(fā)現(xiàn)siRNA[9,88,109]。再者，有效切割的必備條件為堿基配對序列的中間序列完全互補(bǔ) (種子序列[110])，只有完全互補(bǔ)才能被PIWI 域切割。這一點(diǎn)在同為小分子RNA 的miRNA 動力學(xué)研究中被證實(shí)。通過miRNA 動力學(xué)分析可得出，低豐度的miRNA 一般不能產(chǎn)生有生物學(xué)意義的調(diào)控，因?yàn)樗鼈兊臐舛鹊陀诤诵钠ヅ浒悬c(diǎn)的解離常數(shù) (Kd值) (小鼠AGO2 為3.7 pmol/L，果蠅AGO2 為20 pmol/L)[111]。最后，RNAi 過程還受到其他因素的調(diào)控，如siRNA 降解酶和RNAi 調(diào)節(jié)因子ERI-1至ERI-9[112-116]。到目前為止，尚不清楚調(diào)控RNAi效率變化的真正機(jī)制。

3 核酸殺菌劑對傳統(tǒng)殺菌劑的影響

目前，生產(chǎn)中植物病原真菌的防治主要依靠化學(xué)殺菌劑，但因其使用時間長、使用范圍廣等，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、抗藥性等負(fù)面問題頻發(fā)?；赗NAi 的核酸農(nóng)藥特異性高、無殘留，更符合當(dāng)今社會對于環(huán)境友好農(nóng)藥的需求，因此成為潛在的新型綠色植保產(chǎn)品，引起了當(dāng)前市場趨勢的變化。

首先，核酸農(nóng)藥可以減少農(nóng)藥用量并可治理有害生物抗藥性。核酸農(nóng)藥的應(yīng)用可以降低田間化學(xué)農(nóng)藥的用量。由于光譜性化學(xué)農(nóng)藥大范圍的頻繁使用，導(dǎo)致有害生物抗藥性問題頻發(fā)，化學(xué)農(nóng)藥的防治效果不斷下降。此外，抗藥性問題還會引發(fā)突發(fā)性的防治失敗，造成農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量下降甚至絕收，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食安全帶了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。由于作用機(jī)制不同，RNAi可以用來治理有害生物對化學(xué)農(nóng)藥的抗性問題。例如，通過Faβ2Tub-3 dsRNA 沉默β2-tubulin可顯著降低真菌對多菌靈的抗性。更令人驚訝的是，多菌靈延長了Faβ2Tub-3 dsRNA 的持效時間[86]。同樣，應(yīng)用dsRNA 可以通過抑制鐮刀菌靶基因Myosin 5(Myo5)的表達(dá)，降低亞洲鐮孢菌的侵染以及對氰烯菌酯(殺真菌劑JS399-19) 的抗性[88]。還有另一個例子，RNAi 能夠治理田間種群對殺蟲劑的抗性。西方玉米根蟲是一種適應(yīng)性強(qiáng)的入侵害蟲，嚴(yán)重危害玉米，對幾乎所有的化學(xué)殺蟲劑都產(chǎn)生了抗藥性。目前已成功開發(fā)培育出表達(dá)vATPaseAdsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米，可以有效控制西方玉米根蟲[117]。這種基于RNAi 技術(shù)的產(chǎn)品已獲得EPA 批準(zhǔn)[118]。

然而，也要認(rèn)識到核酸藥劑同樣存在抗藥性風(fēng)險?；诳顾幮援a(chǎn)生機(jī)制，結(jié)合RNAi 的原理和特點(diǎn)，我們列出了3 種可能影響RNAi 效率的抗藥性機(jī)制： (i) 靶基因變異。RNAi 基因的多態(tài)性和突變可導(dǎo)致dsRNA 和mRNA 序列的不匹配，從而產(chǎn)生抗藥性[119-120]。一個極端的例子是植物病原細(xì)菌和釀酒酵母S.cerevisiae，由于缺乏可識別的Argonaute、Dicer 和RdRP 同源物，對RNAi 藥劑存在天然抗性[121]。此外，RNAi 基因的表達(dá)變化 (如StauC、V-ATPase B和VATPase d) 也可以改變細(xì)胞對RNAi 藥劑的敏感性[122]。(ii)靶標(biāo)物種對dsRNA 的吸收降低。最近的研究發(fā)現(xiàn)，不同真菌的R N A 攝取效率不同。炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides不能吸收dsRNA，致病疫霉P.infestans不同細(xì)胞類型和發(fā)育階段吸收效率也各有不同[65]。(iii) RNAi 效率的穩(wěn)定性。如前文所述，RNAi 表型變化頻繁。在某些情況下，RNAi 藥劑對真菌的藥效穩(wěn)定性差。RNAi 效率的不穩(wěn)定性可能與已報道的RNAi元件無關(guān)，而與靶mRNA 結(jié)構(gòu)的調(diào)控有關(guān)[108]。

其次，新型RNAi 產(chǎn)品的開發(fā)速度要快于化學(xué)殺菌劑。與化學(xué)農(nóng)藥相比，RNAi 的研制過程相對簡單，研制成本較低。目前，因?yàn)樾禄瘜W(xué)先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)難度逐年增加，開發(fā)一種新型化學(xué)農(nóng)藥需要花費(fèi)近12 年的時間，且成本超過2.8 億美元[123]。相比之下，在美國，開發(fā)RNAi 藥劑的成本約為300 萬～700 萬美元，上市時間約為18～24 個月[124]。與化學(xué)藥劑相比，RNAi 的候選物更易篩選。一旦該基因在真菌的生長、發(fā)育和致病性中起重要作用，靶向該基因的RNA 分子就可能起到保護(hù)植物的作用。不過，RNA 的合成成本高于化學(xué)殺蟲劑[77]。但是隨著技術(shù)的發(fā)展，dsRNA 的生產(chǎn)成本逐年降低，2008 年的成本為1.25 萬美元/g，2018 年已降至60 美元/g。2020 年，RNAGri (一家生物技術(shù)公司，前身為APSE) 專注于噸量級dsRNA 的生產(chǎn)與純化，開發(fā)出一套由大腸桿菌生產(chǎn)APSE RNA 容器 (ARC) 的系統(tǒng)，能夠大量生產(chǎn)封裝可直接噴霧的dsRNA，已將RNA 生產(chǎn)成本降低到1 美元/g[94]。不久之后，Greenlight?系統(tǒng)將進(jìn)一步把dsRNA 合成成本降低到小于0.5 美元/g ( https://www.greenlightbiosciences.com/)。

最后，政府部門的投資在RNAi 產(chǎn)品開發(fā)方面起著舉足輕重的作用。綠色、高效、環(huán)保是未來殺菌劑的發(fā)展趨勢。由于目前RNAi 殺菌劑的大規(guī)模應(yīng)用前景還不明朗，所以很難吸引到私營企業(yè)的投資。當(dāng)前，大多數(shù)RNAi 殺菌劑的項(xiàng)目都是由政府資金資助，由高校及研究所進(jìn)行研究。不同收入國家政府部門在科學(xué)技術(shù)研發(fā)方面的投資存在差異[125]。例如：中國、印度和巴西等政府大大提高了農(nóng)業(yè)研究能力和農(nóng)業(yè)產(chǎn)量，但撒哈拉以南的非洲政府對科研的投資總體上已停滯或呈下降趨勢[126]。由于RNA 藥物研究熱度的提升，全球從2018 年開始，與RNAi 殺菌劑相關(guān)的基礎(chǔ)研究大幅增加。

4 結(jié)論

RNAi 是一項(xiàng)強(qiáng)有力的技術(shù)，不僅可以開發(fā)為新一代農(nóng)藥單獨(dú)使用，還可以將RNAi 藥劑與化學(xué)農(nóng)藥結(jié)合使用，解決當(dāng)前生產(chǎn)實(shí)際中的問題。盡管最近RNAi 抗蟲產(chǎn)品已經(jīng)獲得EPA 的批準(zhǔn)，但RNAi 的大規(guī)模商品化仍面臨一些困難。在真菌中，dsRNA 的攝取、遞送和RNAi 的穩(wěn)定性等RNAi 相關(guān)機(jī)制仍未完全明確。開發(fā)RNAi 生物殺菌劑作為一種有效且環(huán)境安全的植物病害防治方法是一個長期目標(biāo)。在目前RNAi 殺菌劑面臨各種障礙和問題的情況下，我們認(rèn)為最有可能實(shí)現(xiàn)的是將RNAi 殺菌劑與化學(xué)殺菌劑協(xié)同使用，可以獲得最大效益。一方面可以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，一方面可以治理化學(xué)農(nóng)藥抗藥性問題。首先，因?yàn)镽NAi 殺菌劑機(jī)理與化學(xué)殺菌劑不同，所以可以對已產(chǎn)生化學(xué)殺菌劑抗藥性的群體產(chǎn)生選擇壓，延緩抗藥性群體的擴(kuò)展；其次，協(xié)同使用可能存在增效作用，減少藥量的同時可以提高RNAi 和化學(xué)殺菌劑的防治效果；最后，由于RNAi 殺菌劑一般是水溶性的，它可以減少化學(xué)農(nóng)藥中溶劑、添加劑和其他化學(xué)品的使用?？傊怂徂r(nóng)藥是適應(yīng)未來農(nóng)業(yè)發(fā)展方向的極具潛力的新型植物保護(hù)產(chǎn)品，對我國的糧食安全具有重要的戰(zhàn)略意義。