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        非洲豬瘟病毒CD2v胞內區(qū)蛋白間接ELISA方法的建立及初步應用

        2023-03-14 05:53:16王新凱楊芷翊周華亮唐金明黃超華曹琛福賈偉新
        中國動物檢疫 2023年3期
        關鍵詞:陰性抗體陽性

        王新凱,楊芷翊,周華亮,唐金明,3,黃超華,曹琛福,賈偉新

        (1.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院,國家非洲豬瘟區(qū)域實驗室(廣州)/人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室/農業(yè)農村部人畜共患病重點實驗室/農業(yè)農村部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室/廣東省動物源性人獸共患病防控重點實驗室,廣東廣州 510642;2.深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心,廣東深圳 518045;3.深圳市龍崗區(qū)吉華街道公共事務中心,廣東深圳 518100)

        非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的高度傳染性疫病,所有年齡段的野豬和家豬對其均易感,其高死亡率和快速傳播給全世界養(yǎng)豬生產造成巨大經濟損失[1]。ASFV是一種較大的具有二十面體結構的雙鏈DNA蟲媒性囊膜病毒,是目前已知的唯一蟲媒傳播DNA病毒[2-3]。ASFVEP402R基因編碼的CD2v蛋白是一種跨膜蛋白,具有N端信號肽和1個跨膜結構域,與宿主CD2蛋白有相似之處[4]。ASFV CD2v蛋白與宿主CD2蛋白共有2個IgSF結構域,包括1個缺乏常見二硫鍵的N末端V型結構域和1個膜近端C型結構域。CD2v蛋白是細胞外病毒粒子與紅細胞結合所必需的物質,具有介導ASFV感染細胞周圍出現紅細胞吸附(HAD)的功能[5]。從分離毒株的基因組中刪除EP402R基因,不會影響該病死亡率,但會延遲病毒血癥的發(fā)生以及延長病毒傳播到組織的過程[5]。

        近年來,全球范圍內出現了EP402R基因缺失的ASFV突變毒株,并已在我國流行[6-8]。在3 660份國內樣本中分離出22株ASFV毒株,其中11株為CD2v蛋白未表達的低毒力自然突變株,占50%[6,8]。EP402R基因缺失是野生型ASFV突變株的主要特征,導致翻譯的早期終止和移碼突變,從而在感染的巨噬細胞中產生非血吸附表型[8]。先前的研究[6,8]發(fā)現,感染CD2v蛋白未表達的ASFV低毒力自然突變株的豬可以排出病毒,并表現出關節(jié)炎、皮膚壞死等病癥,但缺乏野生型ASFV感染的典型臨床癥狀。當使用世界動物衛(wèi)生組織(WOAH)推薦的熒光定量PCR(qPCR)和ELISA方法檢測時,在口腔、直腸和血液樣本中很難區(qū)分出CD2v缺失株,這給ASF防控帶來了更大挑戰(zhàn)[8]。因此,需要開發(fā)一種檢測方法來區(qū)分CD2v缺失的自然突變株和野生型ASFV毒株。

        1 材料與方法

        1.1 血清、表達質粒、菌株

        重組表達質粒pET-28a-CD2v-IS,購自生工生物工程(上海)股份有限公司;BL21(DE3)感受態(tài)細胞,購自北京全式金生物技術有限公司;ASFV標準陽性血清、ASFV CD2v缺失株標準陽性血清,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;ASFV、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、O型口蹄疫病毒(FMDV-O)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)等抗體陽性血清以及116份已知抗體檢測結果的豬血清、54份未知抗體檢測結果的豬血清(此前采集,未檢測),均由華南農業(yè)大學人畜共患病實驗室保存并提供。

        1.2 主要試劑

        LB培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、20×ELISA洗滌液、ELISA底物液、ELISA終止液,均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;10×ELISA包被液,購自索萊寶公司;封閉液,購自Thermo公司;HIS單克隆抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗豬IgG,購自Abcam公司;HIS標簽蛋白純化試劑盒,購自碧云天公司;增強型HRPDAB顯色液,購自TIANGEN公司。

        1.3 CD2v蛋白生物信息學分析

        從GenBank中下載WUHAN 2019-1株ASFVEP402R基因序列(登錄號:MN393476.1),利用Hphob./Kyte &Doolittle法蛋白疏水性預測網站(https://web.expasy.org/protscale/),對CD2v蛋白編碼基因全長親水性進行分析,截取親水性強的區(qū)域。

        1.4 CD2v重組蛋白原核表達及純化

        1.4.1 CD2v重組表達質粒構建 將1.3中截取的CD2v蛋白氨基酸序列(232~333 aa),根據大腸桿菌密碼子偏嗜性進行優(yōu)化后,在pET-28a(+)表達載體的NcoI與XhoI酶切位點之間插入,構建出重組蛋白表達質粒pET-28a-CD2v-IS,委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

        1.4.2 CD2v重組蛋白誘導表達與鑒定 將pET28a-CD2v-IS重組質粒轉化到BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細胞,挑取單菌落接種于含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng);經菌液PCR鑒定驗證成功轉化后,按照1:100的比例接種于新的含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600nm為0.6~0.8;加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L,經16 ℃、220 r/min誘導表達20 h,收集菌體沉淀;經PBS洗滌后重懸,冰浴下超聲破碎后,分別收集上清與沉淀制樣,并設置未誘導組與pET-28a(+)空載體的陰性對照,進行SDSPAGE與Western-blot試驗,分析重組蛋白表達情況與抗原性;按照上述蛋白表達條件大量誘導表達目的蛋白,收集菌體破碎后的上清液,用0.22 μm的濾膜過濾后,使用碧云天公司的HIS標簽蛋白純化試劑盒,參考其說明書對重組蛋白進行純化。

        1.5 基于CD2v重組蛋白間接ELISA方法的建立

        1.5.1 最佳反應條件優(yōu)化 將純化后的蛋白分別使用1×包被液稀釋成不同質量濃度(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μg/mL),分3批進行包被,每個包被濃度做2個重復;4 ℃包被過夜后棄去抗原液,每孔使用300 μL的1×PBST洗滌1遍;每孔加入100 μL封閉液,37 ℃封閉1 h后棄去封閉液;每孔加入100 μL稀釋過的ASFV陽性血清和陰性血清作為一抗,進行間接ELISA試驗,以P/N最大值且標準方差最小對應值為最佳抗原蛋白包被濃度。根據已確定好的最佳包被濃度,分別對ASFV陰陽血清稀釋倍數(2倍倍比稀釋:1:5~1:160)、一抗孵育時間(30、60、90、120 min),山羊抗豬HRP-IgG稀釋倍數(1:5 000、1:10 000、1:20 000、1:30 000、1:40 000),二抗孵育時間(15、30、45、60 min),底物孵育時間(2.5、5.0、7.5、10.0 min)進行優(yōu)化;按照以上不同條件進行棋盤篩選,每種試劑均為100 μL/孔,每次更換試劑時均使用1×PBST洗滌3次,每次300 μL,確定間接ELISA方法的最佳反應條件。

        1.5.2 臨界值確定 用上述優(yōu)化后的間接ELISA方法分別檢測74份已知ASFV抗體陰性血清與42份已知ASFV抗體陽性血清,每份血清做兩個重復,計算所有陰性血清OD450nm的平均值與變異系數(CV),以其平均值+3×CV的值除以平均值作為臨界值,大于該臨界值判定為陽性,小于該臨界值判定為陰性。

        1.5.3 特異性試驗 選取ASFV(CD2v編碼基因缺失)抗體陽性血清2份、PRV-gE抗體陽性血清4份與CSFV、PRRSV、FMDV-O、PCV2抗體陽性血清各5份,并設置ASFV陽性血清與陰性血清對照,采用本試驗中優(yōu)化的間接ELISA方法進行檢測,以評價所建立ELISA方法的特異性。

        1.5.4 敏感性試驗 將ASFV標準陽性血清按 1:10~1:5 120進行倍比稀釋,采用優(yōu)化的間接ELISA方法,檢測不同稀釋倍數的標準陽性血清,以評價所建立ELISA方法的敏感性。

        1.5.5 重復性試驗 使用同一批次包被的酶標板檢測4份血清,每份血清2個重復,以確定所建立ELISA方法的批內變異系數;使用不同批次包被的酶標板檢測4份血清,每份血清2個重復,以確定所建立ELISA方法的批間變異系數。

        1.5.6 符合性試驗 用本研究建立的間接 ELISA 方法(方法A)、北京金諾百泰生物技術有限公司生產的ASFV抗體檢測試劑盒(方法B)以及WOAH推薦的間接ELISA方法(方法C),同時對46份已知檢測結果的血清與54份未知檢測結果的臨床樣本進行檢測,計算兩者的符合率。

        2 結果

        2.1 CD2v編碼基因生物信息學分析

        2.1.1 CD2v蛋白疏水性分析 CD2v蛋白全長疏水性分析預測結果(圖1)顯示,CD2v蛋白胞內區(qū)親水性強,適合進行上清表達。

        圖1 CD2v蛋白疏水性分析結果

        2.1.2 CD2v編碼基因優(yōu)化后序列 對CD2v蛋白全長進行生物學分析后,選取親水性強的232~333 aa所對應的基因,根據大腸桿菌密碼子偏嗜性優(yōu)化后的序列為,ATGCGTAAACGTAAA AAACACGTTGAAGAAATCGAAAGCCCGCCG CCGGAATCTAACGAAGAAGAACAGTGCCAG CACGATGATACCACCAGCATCCACGAACCGA GCCCGCGTGAACCGCTGCTGCCGAAACCGTA TAGCCGTTATCAGTATAACACCCCGATCTACT ACATGCGTCCGTCTACCCAGCCGCTGAACCC GTTCCCGCTGCCGAAACCGTGTCCGCCGCCG AAACCGTGCCCGCCGCCGAAACCATGCCCGC CACCGAAACCGTGCCCGAGCGCAGAATCTTA CTCTCCGCCGAAACCG。

        2.2 CD2v重組蛋白原核表達

        2.2.1 重組表達質粒鑒定 利用T7通用型引物對挑取的單菌落進行PCR鑒定,PCR產物經生工生物工程(廣州)股份有限公司測序發(fā)現,ASFV CD2v蛋白胞內區(qū)基因序列擴增長度與預期一致(594 bp),插入位置及開放閱讀框均準確無誤,表明重組表達質粒構建成功。

        2.2.2 CD2v重組蛋白誘導表達 取1.4.2中制備的蛋白進行SDS-PAGE與Western-blot試驗發(fā)現:CD2v-IS重組蛋白主要以可溶性形式表達存在,相對分子質量約為15 ku,與預期大小一致(圖2-A);使用ASFV標準陽性血清作為一抗,HRP標記的山羊抗豬IgG作為二抗進行孵育,結果發(fā)現單一特異性條帶,相對分子質量約為15 ku,與預期大小一致(圖2-B),表明該重組蛋白抗原性良好。按照蛋白純化試劑盒說明書純化重組蛋白,利用SDS-PAGE分析其純化效果,結果發(fā)現重組蛋白純化后在15 kDa處有單一條帶,純化效果好,經測NanoDrop One微量核酸蛋白濃度測定儀測定質量濃度為31 μg/mL(圖2-C);將純化后的蛋白用PBS稀釋并加入10%的甘油,分裝后于-80 ℃進行保存。

        圖2 CD2v-IS表達的SDS-PAGE(A)、Western-blot(B)及其純化(C)的鑒定結果

        2.3 基于CD2v重組蛋白的間接ELISA方法建立

        2.3.1 最佳反應條件確定 通過對1.5.1中設置不同優(yōu)化條件依次進行測定后,確定該間接ELISA方法最佳反應條件結果見表1。

        表1 間接ELISA方法反應條件的優(yōu)化結果

        2.3.2 陰陽性臨界值確定 利用優(yōu)化的間接ELISA方法,對74份背景清晰的ASFV抗體陰性血清與42份背景清晰的ASFV抗體陽性血清進行間接ELISA檢測,結果發(fā)現陰性血清OD450nm為0.132 5~0.455,陽性血清OD450nm為1.039~2.113(圖3)。分析計算結果顯示:74份陰性血清樣本的OD450nm平均值為0.271,變異系數(CV)為0.072 6,由此確定陰、陽判定臨界值為1.61。應用此臨界值可以很好地對陰陽血清進行區(qū)分。

        圖3 陰陽血清的OD450nm分布范圍

        2.3.3 間接ELISA方法特異性試驗 用建立的間接ELISA方法對ASFV(CD2v缺失)株、PRRSV、FMDV-O、PRV-gE、CSFV、PCV2抗 體陽性血清進行檢測,結果發(fā)現6種病毒的抗體陽性血清S/N值均<1.61(圖4),均為陰性,表明該方法具有良好的特異性。

        圖4 特異性試驗結果

        2.3.4 間接ELISA方法敏感性試驗 用建立的間接ELISA方法檢測稀釋不同倍數的ASFV標準陽性血清,每個稀釋度做2個重復,結果發(fā)現非標準陽性血清稀釋至1 280倍時,S/N仍大于1.61(圖5),呈現陽性結果,說明該方法具有很好的敏感性。

        圖5 敏感性試驗結果

        2.3.5 間接ELISA方法重復性試驗 根據1.5.6中所述試驗步驟進行重復性試驗,結果發(fā)現批間變異系數均小于9.84%,批內變異系數小于4.15%(表2),證明所建立的ELISA方法具有很好的批間與批內重復性。

        表2 本研究建立的間接ELISA重復性試驗結果

        2.3.6 間接ELISA方法符合性試驗 46份已知檢測結果臨床血清樣本檢測結果(表3)顯示:3種方法的檢測結果與已知樣本檢測結果完全符合,符合率為100%。54份未知檢測結果的臨床樣品檢測結果(表4)顯示:利用方法A檢測,全部為ASFV陰性樣品;使用方法B檢測出5份ASFV陽性樣品、49份陰性樣品;使用方法C檢測出4份ASFV陽性樣品、50份陰性樣本。方法A與方法B、C的符合率分別為90.7%與92.6%。匯總100份臨床血清樣本的檢測結果可知,本研究建立的ELISA方法與商品化試劑盒、WOAH推薦的間接ELISA方法的符合率分別為95.0%與96.0%,符合率較高。

        表3 3種ELISA方法對已知臨床樣本檢測結果對比

        表4 3種ELISA方法對未知臨床樣本檢測結果對比

        3 討論

        ASFV的CD2v蛋白是一種高度糖基化外膜蛋白[9],其抗原性目前未知。研究[10]表明,糖基化蛋白是禽網狀內皮組織增生癥病毒最重要的免疫原性抗原。因此,ASFV的糖基化CD2v蛋白可能在感染細胞中具有重要功能,推測作為抗原進行ELISA方法的建立是可行的;CD2v蛋白在ASFV感染期間也可能與宿主細胞的糖基化受體有關,重組CD2v蛋白可用于研究受體和配體之間的相互作用,但其過程需要進一步研究。ASFV通過CD2v蛋白在感染的巨噬細胞中表現出HAD活性,說明該蛋白的缺失可導致非HAD表型[11]。2017年葡萄牙出現的非HAD基因I型分離株以及歐洲出現的非HAD基因II型分離株[6-7],均表現病毒毒力減弱現象。最近,缺失CD2v的ASFV毒株在我國也被檢測到,導致非HAD表型[8]。ASFV CD2v缺失株可導致非致死性、亞急性或慢性疾病以及持續(xù)感染,并且存在排毒不規(guī)則、易造成病原大規(guī)模傳播的特點,對于感染豬的口腔和直腸拭子很難基于病毒DNA使用WOAH推薦的qPCR方法進行鑒別檢測[8]。本研究基于重組CD2v蛋白建立的ELISA方法結合WOAH推薦的ELISA方法,可用于區(qū)分ASFV野生型毒株和CD2v缺失毒株,如果此方法能用于實驗室檢測,將在ASF流行病學及診斷中發(fā)揮重要作用。

        以CD2v重組蛋白作為包被抗原建立ELISA方法,國內已經展開相關研究。周曉慧等[12]通過原核表達CD2v抗原指數較高的部分蛋白并以此建立的間接ELISA方法,蔣志勇等[13]使用CHO-K1細胞真核表達出CD2v全長蛋白并以此建立的間接ELISA方法,均具有一定參考意義。本研究通過對CD2v蛋白內膜區(qū)域進行低成本、簡單、快速、高產量原核表達及純化,并且利用ASFV(CD2v)缺失株標準陽性血清進行了特異性試驗,建立的ELISA方法更加完善。在進行抗原濃度包被時,為使抗原抗體能夠充分結合,選擇不同包被批次對背景清晰的ASFV野毒感染抗體陽性血清與田間陰性血清進行檢測,旨在找出不同條件下進行抗原包被都能達到最佳檢測效果的濃度。在符合性試驗中,用于檢測的已知樣本皆背景清晰且采樣于CD2v缺失株出現之前,所以本研究建立的ELISA方法能夠表現出較好的符合性及特異性。對于本研究建立的ELISA方法與商品化試劑盒,對近期采集的臨床樣本檢測的陰性結果不符現象,可能是由于CD2v蛋白免疫原性較低以及其抗體產生時間較晚導致無法檢測出來[12-13]。但是在本研究中篩選的背景清晰的已知樣本中,也有感染前中期發(fā)病癥狀并不明顯的樣本,但檢測依然具有很高的陽性值。P30蛋白也屬于病毒顆粒中含量較少的結構蛋白,與CD2v含量接近,卻依然能夠刺激機體產生較強的免疫應答[14]。所以這些樣本是否因為CD2v蛋白本身的特殊性無法檢測到,還需要進一步研究。最近的ASF流行病學調查顯示,這些陰性樣本中可能存在CD2v缺失株[8],使得本研究建立的ELISA方法能夠檢測出較多的陰性樣本。本研究使用的商品化間接ELISA抗體檢測試劑盒的包被抗原為P30重組蛋白,而WOAH推薦使用的間接ELISA方法包被抗原為全病毒蛋白,即使是CD2v缺失株也能夠被檢測出來,導致兩種方法出現多份血清樣本檢測結果的差異性。這在一定程度上證實了本研究建立的間接ELISA方法可以很好地檢測出ASFV野毒感染樣本,而無法檢測出ASFV(CD2v)缺失株陽性血清,如果同時結合其他ASFV結構蛋白制成的ELISA檢測試劑盒,可以確定是否為CD2v缺失株感染。

        本研究前期預試驗中使用TBST作為樣品稀釋液進行檢測,發(fā)現一些陰性樣本檢測結果為弱陽性。為減少此種檢測結果的出現,參考本實驗室專利[15]對樣品稀釋液進行優(yōu)化,使用不含有靶標抗原的大腸桿菌破碎上清液作為樣品稀釋液,將樣品中的非特異性IgG在液相環(huán)境中消除,從而達到檢測結果的準確性。在符合性試驗中,由于多份樣品處理不當導致溶血,在檢測過程中將此類樣品與正常樣品進行分類檢測,結果顯示本研究建立的間接ELISA方法可以很好地避免陰性樣本由于溶血而造成的假陽性結果,增加了檢測結果的可信度。

        4 結論

        綜上所述,本研究通過原核表達系統(tǒng)表達純化了CD2v內膜重組蛋白,并以此蛋白作為包被抗原建立并優(yōu)化了間接ELISA方法。該方法具有很好的特異性、敏感性和重復性,對ASFV(CD2v)缺失株、PRRSV、FMDV-O型、PRV-gE、CSFV、PCV2等常見的豬病抗體陽性血清均無交叉反應,可檢測到稀釋1 280倍的ASFV標準陽性血清樣本,如果同時結合其他ASFV結構蛋白制成的ELISA檢測試劑盒,可應用于ASFV野毒感染與CD2v缺失株感染的鑒別診斷。

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