劉 然，張 琳，陳思旭，史曉娜，劉淑英

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

梅迪-維斯納?。∕aedi-visna disease，MVD）是由逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬的梅迪-維斯納病毒（Maedi-visna virus，MVV）所引起的綿羊的一種慢性、進行性、接觸性疾病[1]。該病可引起患病動物消瘦、呼吸困難、麻痹、跛行和多器官炎癥反應(yīng)[2]，組織病理學(xué)可見淋巴濾泡增生和肺泡間質(zhì)增寬[3]。MVD在世界許多養(yǎng)羊國家普遍存在[4]，且MVV可在宿主體內(nèi)造成持續(xù)感染[5]。MVD給國內(nèi)外養(yǎng)殖戶造成了一定經(jīng)濟損失，目前尚無有效疫苗和藥物對其進行防治[6-7]。因此需要建立早期、快速、有效的診斷方法，及早發(fā)現(xiàn)并進行防控。

診斷MVD的常用方法有病理剖檢和實驗室診斷。病理剖檢存在一定局限性，無法在生產(chǎn)實踐中廣泛使用[8]。實驗室診斷包括血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測。血清學(xué)檢測常用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），但MVD潛伏期長，血清轉(zhuǎn)化需要數(shù)周甚至數(shù)月[9-10]，這期間感染動物持續(xù)排毒，作為傳染源長期影響羊群健康[11]；分子生物學(xué)檢測方法主要是PCR和熒光定量PCR，相較于ELISA，其可以直接檢測動物體內(nèi)的病毒核酸[12]，雖然能夠?qū)崿F(xiàn)早期診斷，但程序繁瑣、耗時較長等缺點也限制了其在基層實驗室的使用。因此建立一種簡便、快速的MVV檢測方法具有重要實踐意義。

隨著診斷技術(shù)的不斷更新，臨床診斷更加追求準(zhǔn)確高效。Piepenburg等[13]于2006年提出了一項新型恒溫擴增技術(shù)——重組酶聚合酶恒溫擴增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）。通過重組酶、DNA聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白在37～42 ℃條件下擴增，再以側(cè)向流紙層析或?qū)崟r熒光等方法展現(xiàn)結(jié)果[14]。而熒光RPA結(jié)合了熒光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)（LAMP）的優(yōu)點，僅需一條探針和引物對，在恒溫條件下短時間內(nèi)即可獲得診斷結(jié)果[15]。因此本研究選擇基于MVVgag基因保守序列設(shè)計特異性引物和探針，以MVV病肺組織DNA為模板，建立MVV實時熒光RPA檢測方法，以期為MVD的診斷提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病料組織及相關(guān)病原

自然感染MVV的肺組織，由本實驗室保存。其他病原：小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）、羊敗血性鏈球菌（ovineStreptococcosis septicemia，OSS），由本實驗室保存；牛腸道病毒（bovine entero virus，BEV）、傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type3，BPIV3）、肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，MO），由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)郝永清教授實驗室提供。

1.2 主要試劑與儀器

動物組織、細(xì)胞與昆蟲總RNA快速提取試劑盒、血液/組織/細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒和瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒，購自北京金佰特生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Vazyme；TwistAmp exo kit試劑盒，購自英國TwistDx Inc公司；核酸恒溫擴增熒光檢測儀AGS8800，購自杭州安譽科技有限公司。

1.3 引物、探針設(shè)計與合成

參照GenBank（登錄號MW248464）中MVVgag基因序列，運用Primer Premier 5.0軟件，按照RPA引物探針設(shè)計原則，設(shè)計7對引物和1條探針，并合成gag-PCR[16]和LTR-PCR[17]試驗所需引物。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST驗證引物特異性后，送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。具體見表1～2。

表1 PCR引物信息

1.4 熒光RPA方法建立

1.4.1 陽性模板鑒定 提取MVV感染肺組織的DNA，通過LTR-PCR擴增目的片段并進行鑒定，將鑒定為MVV陽性的組織DNA作為模板備用。

表2 RPA引物和探針信息

1.4.2 核酸提取及其他病原模板制備 提取PPRV、BEV和BPIV3 RNA，使用酶標(biāo)儀檢測質(zhì)量濃度與純度，分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用；提取IBRV、OSS和MO DNA備用。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 熒光RPA反應(yīng)體系和反應(yīng)條件確定 使用TwistAmp exo Kit進行熒光RPA擴增，反應(yīng)總體系為50 μL。將47.5 μL預(yù)混液（表3）轉(zhuǎn)移至凍干酶粉反應(yīng)管中，加入2.5 μL（0.28 mmol/L）MgAc溶液啟動反應(yīng)。經(jīng)混勻、瞬離后放入恒溫核酸擴增儀中，4 min后取出混勻，再繼續(xù)反應(yīng)16 min。在整個過程中用儀器收集HEX熒光信號，根據(jù)熒光擴增曲線進行結(jié)果判定。

表3 RPA預(yù)混液體系

1.4.4 最佳引物對及反應(yīng)溫度篩選 將7組引物對進行熒光RPA檢測，結(jié)合熒光擴增曲線，篩選出最佳引物對。在反應(yīng)溫度為37～42 ℃條件下，使用最佳引物對進行熒光RPA檢測，篩選出最佳反應(yīng)溫度。

1.4.5 特異性試驗 在最佳反應(yīng)條件和體系下，將上述提取的各病原核酸以及空白對照作為模板，進行熒光RPA檢測，以驗證該方法的特異性。

1.4.6 靈敏度試驗 以上述提取的MVV病肺DNA為模板，10倍倍比稀釋后進行熒光RPA檢測（包含空白對照），確定靈敏度。同時與PCR檢測結(jié)果進行比較。

1.4.7 重復(fù)性試驗 選取兩個不同質(zhì)量濃度的病肺DNA為模板，進行熒光RPA檢測，并重復(fù)3次。通過熒光曲線達(dá)到閾值的時間計算變異系數(shù)，以驗證建立的MVV熒光RPA檢測方法的穩(wěn)定性。

1.4.8 樣品復(fù)核檢測 對本實驗室保存的MVD陰性和陽性臨床羊肺樣品，分別進行熒光RPA檢測和PCR檢測，并對比二者檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 MVV陽性模板鑒定

對本實驗室保存的自然感染MVV的羊肺組織進行LTR-PCR鑒定，結(jié)果PCR擴增產(chǎn)物約300 bp，條帶單一，大小與目的片段一致（圖1）。

圖1 MVV陽性模板鑒定結(jié)果

2.2 最佳引物對篩選

將探針分別與7組引物對進行熒光RPA檢測，結(jié)果7組引物對均能在約5 min時產(chǎn)生熒光信號，其中F3/R3擴增速度最快，且熒光峰值最高（圖2）。因此，選用F3/R3引物對進行后續(xù)試驗。

圖2 RPA最佳引物對篩選結(jié)果

2.3 最佳反應(yīng)溫度篩選

使用F3/R3引物對，進行熒光RPA檢測以篩選反應(yīng)溫度。結(jié)果（圖3）顯示，37～42 ℃均出現(xiàn)較強的熒光信號。將不同溫度下的熒光吸收值和Ct值結(jié)合繪制折線圖（圖4），發(fā)現(xiàn)39 ℃條件下能夠在較低Ct值獲得最高熒光吸收值。結(jié)果表明此溫度下擴增速率和效率均達(dá)到最佳，故確定該方法的最佳反應(yīng)溫度為39 ℃。

圖3 最佳反應(yīng)溫度篩選結(jié)果

圖4 最佳反應(yīng)溫度篩選折線圖

2.4 特異性試驗

結(jié)果（圖5）顯示，除MVV外，其他病原核酸和空白對照均未出現(xiàn)擴增曲線。結(jié)果表明該方法能特異性檢測到MVV，而與PPRV、OSS、BEV、IBRV、BPIV3、MO等無交叉反應(yīng)。

圖5 RPA特異性檢測結(jié)果

2.5 靈敏度試驗

以10倍倍比稀釋的病肺DNA（質(zhì)量濃度102～10-3pg/μL）為模板，進行熒光RPA檢測。結(jié)果（圖6）顯示，所建立的方法檢測濃度下限為10-1pg/μL，即待測樣品中存在10-1pg/μL以上的病毒就能被檢測到。同時將模板稀釋后（質(zhì)量濃度105～10-1pg/μL），進行g(shù)ag-PCR試驗。結(jié)果（圖7）顯示，PCR靈敏度為103pg/μL。結(jié)果說明RPA檢測靈敏度是PCR的約104倍，且檢測時間顯著縮短。

圖6 RPA靈敏度檢測結(jié)果

圖7 PCR靈敏度檢測結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗

為評估所建立方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性，選取質(zhì)量濃度為105pg/μL和102pg/μL的自然感染MVV的病肺組織DNA，進行熒光RPA重復(fù)性試驗。結(jié)果（圖8）顯示，該方法對于相同質(zhì)量濃度模板的檢測結(jié)果判定一致，均可觀察到擴增曲線，兩種質(zhì)量濃度樣品DNA檢測變異系數(shù)分別為7.28%和4.21%，均小于10%。結(jié)果表明所建立的MVV RPA熒光檢測方法穩(wěn)定性良好。

圖8 RPA重復(fù)性檢測結(jié)果

2.7 樣品復(fù)核檢測

使用MVV熒光RPA和LTR-PCR方法，對實驗室已通過病理組織學(xué)和常規(guī)PCR檢測的MVV陰性和陽性肺組織樣品（共8份）進行復(fù)核。結(jié)果顯示：熒光RPA檢測1、2和7號未出現(xiàn)擴增曲線，其余5份均出現(xiàn)明顯擴增曲線（圖9-A），該結(jié)果與LTR-PCR檢測結(jié)果一致（圖9-B）。結(jié)果表明本研究建立的MVV熒光RPA方法可有效檢出MVV。

圖9 樣品復(fù)核檢測結(jié)果

3 討論

MVD出現(xiàn)臨床癥狀時即為晚期[18]。為對其進行早期防控，減少養(yǎng)殖戶經(jīng)濟損失，本實驗室王多智等[19]和李慧萍等[20]分別建立了檢測MVV的巢式PCR和熒光定量PCR方法。二者能夠有效檢測病羊體內(nèi)MVV，但耗時相對較長，操作復(fù)雜，無法實現(xiàn)快速檢測。因此建立早期快速的MVD診斷方法，對及時淘汰患羊進而凈化羊群顯得尤為重要。

RPA技術(shù)是重組酶與引物結(jié)合形成復(fù)合物，在模板上尋找同源序列后，發(fā)生鏈交換并啟動DNA合成，對目的基因進行指數(shù)擴增。RPA相較于PCR操作簡單，不需要PCR儀等熱循環(huán)儀器設(shè)備[21]。熒光RPA技術(shù)結(jié)合探針，在常溫條件下使用恒溫擴增儀15～30 min即完成實時檢測，具有節(jié)省時間成本、高效便捷的優(yōu)點。同時，反應(yīng)體系所需的酶均以凍干粉形式保存，方便運輸，且儀器體積小易攜帶，適用于現(xiàn)場檢測和基層生產(chǎn)實踐[22-23]。強焜等[24]建立了熒光RPA檢測田鼠巴貝蟲方法，對巴貝蟲病診斷及血液安全風(fēng)險監(jiān)測具有參考意義；郭正洋等[25]建立了單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光RPA檢測技術(shù)，為現(xiàn)場檢測提供快速可靠的方法；張靜遠(yuǎn)等[26]建立了非洲豬瘟熒光RPA檢測方法，給基層防控提供了技術(shù)支撐。以上檢測方法的建立說明熒光RPA技術(shù)已被成熟應(yīng)用于各類病原體檢測，可對寄生蟲以及臟器和血液中的細(xì)菌及病毒進行檢測。這為建立MVV熒光RPA方法，實現(xiàn)MVD早期防控提供了可靠依據(jù)。

靶序列選擇是熒光RPA反應(yīng)實現(xiàn)最優(yōu)效果的主要決定因素。對本研究團隊趙玲等[27]登入GenBank中的MVV全基因組序列（登錄號MW248464）分析發(fā)現(xiàn)，gag區(qū)域的同源性為82.8%～86.8%，序列相對保守，因此選擇gag作為靶基因設(shè)計多對引物/探針并進行篩選。熒光RPA技術(shù)的關(guān)鍵在于引物和探針，其引物序列較常規(guī)PCR引物序列長，引物過短則影響重組效率，降低反應(yīng)的靈敏度和擴增速率。通過對多組引物配合探針的效果進行篩選，發(fā)現(xiàn)F3/R3引物對能夠最快達(dá)到熒光峰值，可用于后續(xù)試驗。除上述內(nèi)在決定因素外，溫度是影響RPA反應(yīng)速率的重要外在因素。因此在篩選最佳引物對后，設(shè)置37～42 ℃溫度梯度進行熒光RPA檢測，發(fā)現(xiàn)39 ℃時能夠在短時間內(nèi)達(dá)到熒光峰值，擴增效果最佳。本試驗結(jié)合擴增熒光峰值和起峰時間，選取F3/R3為最佳引物對，39 ℃為最佳反應(yīng)溫度。值得注意的是，反應(yīng)期間取出反應(yīng)管混勻后放回儀器，目的是充分混勻各組分，提高反應(yīng)速率和靈敏度[28]。

本研究以MVVgag基因保守序列為靶基因，按照TwistDX Inc公司引物和探針設(shè)計原則，設(shè)計并篩選出探針和最佳引物對，建立了在39 ℃、20 min即可檢出MVV的熒光RPA方法。性能評估結(jié)果表明，所建立的方法重復(fù)性好，變異系數(shù)均小于10%；特異性強，與其他常見繼發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病的病原均無交叉反應(yīng)；靈敏度高，最低可檢測MVV核酸質(zhì)量濃度為10-1pg/μL；可信度高，與PCR檢測結(jié)果一致。綜上所述，本研究建立的MVV熒光RPA檢測方法，特異性強，靈敏度高，反應(yīng)快速，操作方法簡單，是快速診斷MVD的有效手段，對基礎(chǔ)設(shè)施相對較差的羊場開展MVD快速篩查具有重要意義。