楊文靜，張富友，劉 娜，王 琳，王素春，潘俊慧，3，禹蘭平，周凱鈺太，張 煒，田 睿，梁晚?xiàng)鳎瑢O福亮，王楷宬，3

（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.延邊大學(xué)，吉林延吉 133000；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警及防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南方），山東青島 266032；4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，CP）最早在19世紀(jì)末從一具腐敗的人類尸體中分離得到，并以發(fā)現(xiàn)者Welchii的名字命名為魏氏梭菌。CP廣泛存在于自然環(huán)境以及人和動(dòng)物的腸道中，對人和動(dòng)物都普遍存在致病性[1]。人類或動(dòng)物感染CP后會(huì)引起食物中毒以及非食源性腹瀉、腸毒血癥、壞死性腸炎等腸道疾病[1-2]。

CP在家禽中主要引起禽壞死性腸炎。1961年禽壞死性腸炎首次在英國肉雞中被發(fā)現(xiàn)，隨后世界范圍內(nèi)的各家禽生產(chǎn)國均有該病報(bào)道，嚴(yán)重影響了全球肉雞貿(mào)易與生產(chǎn)[3]。禽壞死性腸炎可分為急性臨床和輕度亞臨床兩種形式，大多病例表現(xiàn)為亞臨床型，一年四季都可發(fā)生，以夏季最為流行，多發(fā)于2～6周齡雛雞，病死率最高達(dá)50%[4]。

目前，抗生素和疫苗是防治CP感染的有效方法，但商品化疫苗較少，其預(yù)防效果有限，而抗生素的頻繁使用又導(dǎo)致了菌株耐藥性問題。因此，本病防控需要采取加強(qiáng)監(jiān)測等綜合防控措施。本文簡述了CP的病原特點(diǎn)、致病機(jī)理及其優(yōu)勢流行分型，梳理了禽CP不同檢測方法的優(yōu)點(diǎn)及分型方法，闡述了其耐藥性及疫苗的研發(fā)主要方向及進(jìn)展，提出了幾種輔助防治措施，以期為CP感染防控提供參考。

1 病原特性

CP是一種粗短桿狀菌，邊緣筆直，兩端較為整齊，為革蘭氏陽性厭氧菌，呈單個(gè)、成雙或短鏈狀排列，大部分菌在生長過程中都會(huì)形成莢膜[5]。該菌的基因組大小為3.0～4.1 mb，包含2 500～3 600個(gè)預(yù)測基因[6]；可在次級端產(chǎn)生芽孢，因而具有較強(qiáng)的抵抗力，暴露在空氣中1 h仍可存活，用10%的福爾馬林溶液浸泡10 min才能將其殺死；代謝活躍，對營養(yǎng)要求不是很嚴(yán)格，在普通培養(yǎng)基上即可生長，在添加葡萄糖、血液的培養(yǎng)基中生長得更好[7]。

CP可以分解肌肉和結(jié)締組織中的葡萄糖、乳糖、麥芽糖等，并不斷產(chǎn)生氣體，主要為硫化氫?！氨寻l(fā)酵”是該菌的一大特性，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的CP菌液接種到含鐵的牛乳培養(yǎng)基底部，在水浴鍋內(nèi)46 ℃培養(yǎng)2 h，就會(huì)出現(xiàn)爆裂發(fā)酵現(xiàn)象[8]。

2 致病機(jī)理

CP可分泌多種外毒素和酶，目前已知有20多種，其中起主要致病作用的外毒素有α、β、ε、ι、cpe、NetB。不同分型CP的主要致病毒素和致病性見表1。

表1 CP主要致病毒素及其致病性

CP屬于條件性致病菌，當(dāng)外界環(huán)境等因素突變，宿主產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致抵抗力下降時(shí)，腸內(nèi)CP就會(huì)迅速繁殖并產(chǎn)生大量外毒素，毒素粘附于腸黏膜上皮，阻礙營養(yǎng)物質(zhì)在腸道毛細(xì)血管上的吸收和運(yùn)輸，進(jìn)而引發(fā)疾病[9]。

α毒素是一種單鏈多肽蛋白，由位于染色體上的cpa基因編碼，所有類型的CP均可分泌，其可破壞真核細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起人類氣性壞疽、腸毒血癥及禽壞死性腸炎等疾病[10]。β毒素是由B型和C型CP誘導(dǎo)產(chǎn)生的穿孔毒素，由cpb基因編碼，可損壞內(nèi)皮和腸上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致其溶血性壞死，毒性較強(qiáng)，僅次于ε毒素，是導(dǎo)致禽壞死性腸炎的必要毒力因子[11]。ε毒素亦是一種成孔毒素，具有可穿越血腦屏障并與大腦髓磷脂結(jié)合的能力，其毒力僅次于肉毒桿菌毒素和破傷風(fēng)毒素，具有致死性，可導(dǎo)致綿羊腸毒血癥[12]；ι毒素是由質(zhì)粒上的iaq和ibq兩種基因編碼的一種二元毒素，由類毒素Ia和細(xì)胞結(jié)合蛋白Ib兩部分構(gòu)成，只有二者共同存在時(shí)ι毒素才具有細(xì)胞毒性、致死性與致皮膚壞死性的功能[13]。ι毒素會(huì)對動(dòng)物腸道及肝臟造成嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致犢牛、羔羊痢疾，甚至腸毒血癥[14]。Cpe毒素是一種穿孔毒素，其本質(zhì)是一種單一多肽，具有結(jié)合細(xì)胞表面蛋白受體的能力，形成使鈣流入的復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，可引起人類食物中毒和非食源性腹瀉[15]。NetB毒素是由netB基因編碼的一種成孔毒素，可通過刺穿細(xì)胞膜造成滲漏導(dǎo)致細(xì)胞死亡，是引起禽壞死性腸炎的重要毒力因子[16]。TpeL毒素是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種毒素，是梭狀芽孢桿菌毒素家族的一員，是CP產(chǎn)生的一種新型糖基化毒素，可導(dǎo)致嚴(yán)重禽壞死性腸炎病變，并加速病禽死亡[17]。

綜上所述，各毒素可引起畜禽和人類的各種疾病，α毒素及NetB毒素是引起禽壞死性腸炎的主要毒素。早期的研究表明禽壞死性腸炎主要由α毒素引起。自發(fā)現(xiàn)NetB毒素以來，越來越多的研究[16，18]顯示，在全球患壞死性腸炎的家禽中，NetB陽性CP菌株的檢出率越來越高。研究[18]發(fā)現(xiàn)，NetB毒素是禽壞死性腸炎發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵毒力因子。隨后，又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種新毒素——TpeL毒素，且TpeL毒素陽性菌株可加速壞死性腸炎病情惡化。因此，未來應(yīng)更關(guān)注NetB毒素和TpeL毒素的研究。

3 優(yōu)勢流行分型

根據(jù)分泌毒素種類和致病性不同，可以將CP分為A—G 共7個(gè)型[7]。當(dāng)前全球主要流行A型，但 C、F、G型等也有不同程度的檢出[19]，其中對禽類影響最為嚴(yán)重的是A型和G型，主要引起禽壞死性腸炎。

多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（multilocus sequence typing，MLST）是目前細(xì)菌分型方法中的黃金標(biāo)準(zhǔn)，能對基因序列展開更準(zhǔn)確的分析，可以了解細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)和遺傳進(jìn)化特點(diǎn)。根據(jù)8個(gè)等位基因?qū)?yīng)的等位基因編號組合，可以將CP分為不同的ST型。

目前，國內(nèi)外對CP ST型的研究相對較少，全球的優(yōu)勢流行株尚不明確。從目前有限的調(diào)查數(shù)據(jù)來看，不同國家或地區(qū)流行的優(yōu)勢分型并不一致。美國在139株禽源CP中共鑒定出44個(gè)ST型，以ST-9（5.8%）和ST-31（7.2%）居多，其中50%的壞死性腸炎病例由ST-31引起，說明ST-31可能與壞死性腸炎高度相關(guān)[20]；對來自加拿大安大略省南部患壞死性腸炎禽類中分離的61株菌株進(jìn)行MLST分析，結(jié)果檢出22個(gè)ST型，其中ST01（31.1%）和ST18（9.8%）是主要流行分型[21]；對分離自巴西患壞死性腸炎肉雞的20株CP菌株進(jìn)行分析，共檢出10個(gè)ST型，其中ST-23（50%）、ST-21（30%）、ST-24（30%）和ST-27（30%）檢出率較高[22]。國內(nèi)對禽源CP的多位點(diǎn)序列分型研究較少。有研究[23]對來自廣東省以及山東省平陰、泰安和濰坊地區(qū)的74株禽CP進(jìn)行MLST分型，分離到最多的是ST-2（6.76%），其次是ST-48（4.05%）、ST-1（2.70%）、ST-3（2.70%）、ST-13（2.70%）；另有研究[24]發(fā)現(xiàn)，濰坊市某企業(yè)分離的65株禽CP可分為47個(gè)ST型，其中最常見的是ST-3（14.8%）、ST-2（6.15%）和ST-8（4.62%）。

4 檢測及分型方法

4.1 分離鑒定

目前，針對禽CP的分離培養(yǎng)主要有以下幾種方式：在FTG（液體硫乙醇酸鹽）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～8 h，培養(yǎng)液由澄清變?yōu)闇啙?，并有大量氣泡產(chǎn)生；在TSC（胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂）固體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24～48 h，可形成乳白色圓斑包圍著的黑色圓點(diǎn)菌落[25]；在顯色培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后可見橘紅色、邊緣整齊的圓形菌落；在血瓊脂培養(yǎng)基上會(huì)出現(xiàn)表面光滑、內(nèi)圈透明的灰綠色菌落，并形成雙層溶血環(huán)，其內(nèi)環(huán)完全溶血（θ溶血），外環(huán)不完全溶血（α溶血）[26]。CP的分離培養(yǎng)耗時(shí)長，對無菌要求較高，需輔以其他的檢測方法進(jìn)行復(fù)核，可使用PCR、革蘭氏染色、牛乳發(fā)酵和動(dòng)力-硝酸鹽等方法進(jìn)行驗(yàn)證。

4.2 分子生物學(xué)檢測

常見的CP分子生物學(xué)檢測方法有PCR、16S rRNA測序、熒光定量PCR和LAMP。Fach等[27]應(yīng)用PCR首次檢測出了α毒素。隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，16S rRNA測序相較于其他方法具有更便捷、更精確的優(yōu)點(diǎn)，目前已有了通用細(xì)菌擴(kuò)增引物，可以準(zhǔn)確地對細(xì)菌進(jìn)行種群鑒定。熒光定量PCR方法已成為被廣泛認(rèn)可的新型檢測工具，比普通檢測方法更加靈敏。國內(nèi)外已相繼建立了核酸探針檢測方法。Profeta等[28]應(yīng)用熒光定量PCR方法，對意大利養(yǎng)殖場的禽樣品進(jìn)行了α和NetB毒素雙重檢測。該方法特異性好，可同時(shí)對兩種毒力基因進(jìn)行檢測，大大提高了檢測效率。LAMP技術(shù)是2000年由Tsugunori等[29]研發(fā)的一種在等溫條件下擴(kuò)增DNA的方法。該方法具有操作簡單、特異性強(qiáng)、效率高的優(yōu)點(diǎn)，在等溫條件下可在1 h內(nèi)將幾個(gè)DNA副本擴(kuò)增到109，相較普通 PCR方法，更快速且不需要特殊儀器，只需設(shè)計(jì)出合適的特異性引物即可。應(yīng)用此方法進(jìn)行CP檢測，可為由該菌引起的各種疾病的早期臨床診斷和食源性污染檢測提供便利。

4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA是一種基于抗原與抗體特異性結(jié)合的檢測方法，其操作簡單，檢測快速，具有較高的特異性。McCourt等[30]建立了一種檢測CP α毒素的ELISA方法，用于正常肉雞和患壞死性腸炎肉雞腸道標(biāo)本的篩選，提供了一種快速篩查禽壞死性腸炎的檢測方法。吳霜等[31]建立了一種檢測CP β2毒素單克隆抗體的ELISA檢測方法，可用于檢測動(dòng)物血清中CP β2毒素的抗體水平，為檢測禽CP感染提供了有效的檢測手段。

4.4 多位點(diǎn)序列分型（MLST）

MLST是基于管家基因及其內(nèi)部片段核苷酸序列的分型方法，一般測定7～10個(gè)管家基因，每個(gè)管家基因序列長度為400～600 bp。該技術(shù)對擴(kuò)增序列進(jìn)行測序，隨后通過PubMLST網(wǎng)站進(jìn)行ST測定以確定菌株的ST型，有6個(gè)及以上相同等位基因號的ST會(huì)被分到一個(gè)相同的CC組別中，進(jìn)而進(jìn)行菌株相關(guān)性分析[32]。Aung等[19]和Deguchi等[33]應(yīng)用此方法對CP的8對管家基因進(jìn)行測序，并進(jìn)行分型分析。MLST數(shù)據(jù)分析具有群體遺傳學(xué)意義，有助于更清楚地了解CP遺傳特征和壞死性腸炎的流行病學(xué)信息。

4.5 脈沖場凝膠電泳分型（PFGE）

PFGE是一種分離大分子DNA的方法。該方法將限制性內(nèi)切酶消化處理好的細(xì)菌DNA置于脈沖電場電泳儀中進(jìn)行電泳，從而分離不同大小的片段。脈沖場電泳由兩個(gè)相反方向的電場互相交替進(jìn)行，使DNA分子的分子構(gòu)像隨著電泳方向的改變而改變，在凝膠中不斷移動(dòng)，從而成功分離出大小不同的DNA片段，最終根據(jù)電泳結(jié)果選擇相應(yīng)的軟件對其進(jìn)行分析。該方法不僅提高了分辨率，且重復(fù)性和特異性也較好，被廣泛應(yīng)用于許多細(xì)菌的基因分型和同源性分析[34]。Mwangi等[35]和Engstr?m等[36]研究表明，該方法可用于CP的分型鑒定。

5 耐藥性

CP耐藥性問題由來已久，早在20世紀(jì)就已經(jīng)出現(xiàn)關(guān)于CP耐藥性的報(bào)道。很長一段時(shí)間以來，抗生素濫用加劇了CP耐藥甚至多重耐藥菌株的產(chǎn)生。2004年Martel等[37]對比利時(shí)肉雞腸道中分離出的CP菌株進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，63%的菌株對林可霉素表現(xiàn)出低水平耐藥。由于大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類抗生素的作用部位相同，所以CP通常同時(shí)對這兩類抗生素耐藥[38]。2009年Gholamiandehkordi等[39]再次對比利時(shí)肉雞CP的耐藥性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在39個(gè)測試的分離株中，分別有66%和61%的分離株對四環(huán)素和林可霉素耐藥。2011年Slavic等[40]研究發(fā)現(xiàn)，加拿大安大略省超過60%的雞和火雞CP分離株對桿菌肽的敏感性降低。2016年，馬壯[41]分析了廣州市禽CP分離菌株的耐藥性，發(fā)現(xiàn)其對人用抗生素克林霉素和頭孢氨芐的耐藥率分別達(dá)到了75.71%和31.43%。2019年，張匯寧[42]發(fā)現(xiàn)，山東省泰安市禽CP對慶大霉素的耐藥率最高可達(dá)90%。2022年，候照峰等[43]對分離自我國不同地區(qū)的4株禽CP菌株進(jìn)行耐藥研究，證實(shí)其對氨基糖苷類抗生素具有一定耐藥性。這一結(jié)果與Li等[44]及Wei等[45]對我國部分地區(qū)的CP耐藥研究結(jié)果一致。2022年Haider等[46]研究證實(shí)，禽CP對新霉素、甲氧芐啶、四環(huán)素和林可霉素的耐藥性最高，且全部菌株具有多重耐藥性。

綜上，禽CP對四環(huán)素類、氨基糖苷類、多肽類抗生素、林可胺類、大環(huán)內(nèi)酯類等藥物產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性，甚至呈現(xiàn)出多重耐藥，這對人和動(dòng)物健康構(gòu)成威脅，因此分析其耐藥性，對CP感染的預(yù)防和治療具有重要意義。

6 疫苗研發(fā)

目前，禽壞死性腸炎疫苗主要包括類毒素疫苗、亞單位疫苗及活載體疫苗。至今，全球僅有美國 HUVEPHARMA公司生產(chǎn)的一種表達(dá)CP α毒素片段和NetB毒素編碼基因的沙門氏菌活載體疫苗（RASV）上市，這是目前全球唯一的禽CP商品化疫苗。國內(nèi)還沒有針對禽CP的疫苗注冊，相關(guān)疫苗均處于實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段，與商品化還存在一定距離。目前CP疫苗的主要研發(fā)方向是類毒素疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗。

6.1.1 類毒素疫苗 類毒素是一種細(xì)菌毒素，經(jīng)過物理或者化學(xué)方式處理后，只保留免疫原性，其本身無法復(fù)制，安全性高。早在1988年，F(xiàn)ukata等[47]發(fā)現(xiàn)α類毒素疫苗可刺激禽類產(chǎn)生抗體，有效地保護(hù)機(jī)體免受損。2009年劉洪斌等[48]研制出A型CP類毒素疫苗及滅活疫苗，發(fā)現(xiàn)二者對禽壞死性腸炎均有明顯保護(hù)力。2013年Keyburn等[49]對肉用種雞皮下注射經(jīng)基因處理的NetB類毒素制劑，發(fā)現(xiàn)其對肉雞壞死性腸炎具有顯著的保護(hù)作用。當(dāng)前，該類疫苗多與基因工程相結(jié)合，構(gòu)建出可表達(dá)類毒素的重組菌。2018年，Alimolaei等[50]制備了一種表達(dá)CP α類毒素的重組益生菌干酪乳桿菌，作為一種口服候選疫苗，可誘導(dǎo)特異性體液和黏膜抗體，保護(hù)試驗(yàn)小鼠免受α毒素攻擊。2023年，Shamshirgaran等[51]評價(jià)了CP α毒素c端結(jié)構(gòu)域的重組干酪乳桿菌作為一種潛在的基于益生菌的候選疫苗，用于肉仔雞對壞死性腸炎的免疫。

6.1.2 亞單位疫苗 亞單位疫苗是利用工程菌或細(xì)胞等表達(dá)出的一種表面抗原，其不具備傳染性，安全性高且制備簡單，目前被廣泛研究和應(yīng)用。2020年，Katalani等[52]構(gòu)建了含NetB、α毒素和金屬肽酶的融合蛋白（NAM），并在煙草植株中表達(dá)，作為可食用疫苗用于雞壞死性腸炎的免疫，同時(shí)在大腸桿菌BL21中表達(dá)了帶有his標(biāo)記的重組NAM，用于雞的皮下免疫，發(fā)現(xiàn)兩種免疫方式對禽類腸道病變均有明顯保護(hù)作用。2022年，F(xiàn)atemi等[53]以大腸桿菌作為載體，表達(dá)了α毒素、NetB毒素以及AMA1、RON2重組嵌合蛋白，發(fā)現(xiàn)其對禽壞死性腸炎和球蟲模型的保護(hù)率達(dá)84%。同年，F(xiàn)u等[54]制備CP營養(yǎng)細(xì)胞可溶性蛋白和孢子作為疫苗候選蛋白，進(jìn)行細(xì)胞和動(dòng)物試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該候選蛋白可減少壞死性腸炎的組織病理學(xué)變化。6.1.3 活載體疫苗 活載體疫苗是從細(xì)菌抗原中分離提取一種或幾種具有免疫原性的生物學(xué)活性物質(zhì)，因除去了免疫過程中不需要的物質(zhì)，所以更加純凈；且接種后一段時(shí)間內(nèi)可在動(dòng)物體內(nèi)生長繁殖，從而產(chǎn)生更多的保護(hù)性抗原，激起全面的免疫應(yīng)答，刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞及黏膜免疫反應(yīng)。2015年，Jiang等[55]用一種新型減毒沙門氏菌作為載體，表達(dá)了α毒素和NetB 毒素雙重抗原，并制作重組疫苗，皮下接種肉雞，發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)肉雞產(chǎn)生大量腸道IgA、IgY 和IgM 抗體，對肉雞壞死性腸炎有較好的保護(hù)效果。2017年，Rostami等[56]利用大腸桿菌作為宿主，表達(dá)了NetB、α毒素以及TpeL的嵌合蛋白，在進(jìn)行兔血清免疫試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其可中和部分α毒素，從而減輕機(jī)體損傷。2019年，Wilde等[57]用一種經(jīng)過工程改造的減毒沙門氏菌疫苗株作為宿主，通過提供α毒素、NetB毒素及果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（Fba）3種抗原，從而引發(fā)黏膜反應(yīng)，可對CP引發(fā)的病變具有有效的抑制作用。此類疫苗只含有抗原成分，無核酸，因而無不良反應(yīng)，使用安全。

7 其他防控

除通過疫苗和藥物進(jìn)行防治外，研究發(fā)現(xiàn)在日糧中添加益生菌，使用噬菌體制劑及加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，對于禽CP感染的防控也具有重要意義。乳酸桿菌和芽孢桿菌等益生菌不僅對CP具有一定的抑制作用，而且還可以調(diào)節(jié)和改善腸菌群。日糧中添加嗜酸乳桿菌可增加感染CP肉雞的體重并提高肉雞壞死性腸炎存活率[43]。益生菌制劑“枯草芽孢桿菌PB6”相較于在日糧中添加恩拉霉素，可顯著降低肉雞的CP感染程度，從而降低死亡率[58]。Miller等[59]研究表明，噬菌體產(chǎn)品INF-401在控制CP感染方面比類毒素疫苗更有效，且混合噬菌體的控制效果往往優(yōu)于單一噬菌體。Heo等[60]發(fā)現(xiàn)CP噬菌體和細(xì)菌素協(xié)同作用，能夠抑制CP生長，甚至可將其完全清除。此外，加強(qiáng)對禽類養(yǎng)殖管理，提高環(huán)境衛(wèi)生條件，也可對禽CP感染起到一定的預(yù)防作用。

8 結(jié)語

CP是一種重要的食源性人獸共患病病原菌，不僅會(huì)引起禽類的壞死性腸炎、壞疽性皮炎等疾病，還會(huì)通過食物鏈傳播給人類，造成人類氣性壞疽和食物中毒。目前已經(jīng)對禽CP的病原特性、致病機(jī)理有了一定的了解。由于CP疫苗多處于研發(fā)階段，抗生素仍是主要的CP感染防治手段。而抗生素的濫用導(dǎo)致了CP耐藥性加重，使得常規(guī)藥物很難達(dá)到預(yù)期的防治效果。今后需要加快CP疫苗研發(fā)進(jìn)程，科學(xué)合理使用抗生素，深入開展CP耐藥因子及動(dòng)物模型研究，保障養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和人類食品安全。