李承幸 張 玉 王芳芳

1 南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第三附屬醫(yī)院感染科,河南省南陽市 473000；2 南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院感染科

乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)為常見傳染性疾病，臨床研究顯示，我國HBV感染病例中10%～20%可進(jìn)展至肝硬化，且肝硬化中3%～6%可進(jìn)展至原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)，若未及時(shí)干預(yù)，預(yù)后較差[1]。研究表明，HBV感染病情進(jìn)展與機(jī)體外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)凋亡、免疫耐受相關(guān)；PBMC凋亡相關(guān)因子可促使肝臟小葉結(jié)構(gòu)塌陷、上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)患者纖維化病程，加劇肝功能損傷[2]。程序性死亡受體-1(Programmed cell death receptor-1，PD-1)為負(fù)性協(xié)同刺激分子，可抑制機(jī)體HBV特異性免疫細(xì)胞，半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-9(Cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9)在PBMC凋亡線粒體途徑中發(fā)揮重要作用[3-4]。臨床關(guān)于HBV感染中PD-1、Caspase-9的研究較少，故本研究選取我院240例HBV感染患者，旨在分析二者于不同病情階段的表達(dá)意義。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月—2021年10月我院收治的240例HBV感染患者，根據(jù)其病情階段不同分為HBV相關(guān)性HCC組(n=76)、乙肝肝硬化組(n=30)、重度CHB組(n=31)、中度CHB組(n=40)、輕度CHB組(n=63)，同期健康對照組(n=80)，其中HBV相關(guān)性HCC組男40例，女36例，年齡34～58歲，平均年齡(45.82±5.73)歲；乙肝肝硬化組男16例，女14例，年齡32～58歲，平均年齡(45.21±6.14)歲；重度CHB組男17例，女14例，年齡31～57歲，平均年齡(43.98±6.09)歲；中度CHB組男21例，女19例，年齡32～55歲，平均年齡(43.26±5.47)歲；輕度CHB組男35例，女28例，年齡32～57歲，平均年齡(44.07±6.02)歲；健康對照組男43例，女37例，年齡31～56歲，平均年齡(43.12±5.53)歲。各組基線資料均衡可比(P>0.05)，本研究經(jīng)我院倫理委員會審批通過。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HBV表面抗原陽性；(2)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[5]、《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[6]等診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)HBV-DNA定量升高；(4)患者及近親屬均了解本研究并簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有其他嗜肝病毒感染；(2)存在遺傳代謝性肝??；(3)非HBV感染所致肝病(酒精性肝硬化、藥物性肝炎等)；(4)哺乳期、妊娠期女性；(5)存在語言、精神缺陷。

1.3 方法

1.3.1 PBMC表面PD-1、Caspase-9檢測：采集各組5ml清晨空腹靜脈血，離心(3 500r/min，15min)分離血清，采用免疫組化染色SP法檢測各組PBMC表面PD-1表達(dá)，陽性對照：陽性標(biāo)本切片；陰性對照：采用PBS液替換一抗孕育已知的陽性切片。采用美國Bio-Bad全自動酶標(biāo)儀，以雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定Caspase-9，于450nm波長處采用酶標(biāo)儀依次測量各孔吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，采用吸光度值、標(biāo)準(zhǔn)誤濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式計(jì)算Caspase-9濃度。

1.3.2 肝功能相關(guān)指標(biāo)檢測：采集各組5ml清晨空腹靜脈血，離心分離血清，采用全自動生化分析儀(廠家：貝爾曼庫爾特公司，型號：AU5800)及配套試劑檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(廠家：德國艾本德公司，型號：Mastercycler ep realplex)檢測乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)。

1.4 觀察指標(biāo) (1)對比各組PBMC表面PD-1、Caspase-9水平。(2)對比各組肝功能相關(guān)指標(biāo)，包括AST、ALT、HBV-DNA。(3)Pearson分析PBMC表面PD-1、Caspase-9與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性。(4)評估PBMC表面PD-1、Caspase-9聯(lián)合檢測對重度CHB進(jìn)展為HCC的預(yù)測價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 各組PBMC表面PD-1、Caspase-9水平對比 與健康對照組相比，其他各組PBMC表面PD-1、Caspase-9水平均明顯升高，重度CHB組PBMC表面PD-1水平較中度CHB組、輕度CHB組高，Caspase-9水平較中度CHB組、輕度CHB組低(P<0.05)；HBV相關(guān)性HCC組、乙肝肝硬化組PD-1水平對比無顯著差異(P>0.05)；HBV相關(guān)性HCC組Caspase-9水平低于乙肝肝硬化組(P<0.05)，見表1。

表1 各組PBMC表面PD-1、Caspase-9水平對比

2.2 各組肝功能相關(guān)指標(biāo)對比 與健康對照組相比，其他各組AST、ALT、HBV-DNA水平均明顯升高，重度CHB組AST、ALT水平較中度CHB組、輕度CHB組高，HBV相關(guān)性HCC組AST、ALT水平高于乙肝肝硬化組，低于重度CHB組(P<0.05)；除健康對照組外其他各組HBV-DNA水平對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組肝功能相關(guān)指標(biāo)對比

2.3 PBMC表面PD-1、Caspase-9與肝功能指標(biāo)相關(guān)性分析 AST、ALT與PBMC表面PD-1呈正相關(guān)，與PBMC表面Caspase-9呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，PBMC表面PD-1、Caspase-9與HBV-DNA呈弱相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 PBMC表面PD-1、Caspase-9與肝功能指標(biāo)相關(guān)性分析

2.4 PBMC表面PD-1、Caspase-9聯(lián)合檢測對重度CHB進(jìn)展為HCC的預(yù)測價(jià)值評估 經(jīng)ROC曲線分析顯示，PBMC表面PD-1、Caspase-9聯(lián)合檢測預(yù)測重度CHB進(jìn)展為HCC的AUC值為0.902，敏感度90.32%、特異度89.47%均較高(P<0.05)，見表4。

表4 PBMC表面PD-1、Caspase-9聯(lián)合檢測對重度CHB進(jìn)展為HCC的預(yù)測價(jià)值評估

3 討論

HBV感染發(fā)生及病情進(jìn)展過程中，因機(jī)體炎性因子激活、免疫性因子表達(dá)失衡，可引發(fā)肝臟上皮細(xì)胞凋亡、肝臟纖維化等，若未及時(shí)給予針對性干預(yù)，病情持續(xù)進(jìn)展可致肝硬化、肝癌等。有數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)階段CHB治療整體有效率未達(dá)35%，病情進(jìn)展為終末期肝功能衰竭的風(fēng)險(xiǎn)達(dá)15%以上[7]?，F(xiàn)階段，臨床多關(guān)注HBV感染患者相關(guān)凋亡因子或免疫因素，可為其生物學(xué)治療提供參考，對抑制病情進(jìn)展具有積極意義。

PD-1屬CD28/CTLA-4免疫球蛋白抑制性受體，與細(xì)胞凋亡相關(guān)；PD-1結(jié)合配體PD-L可對HBV特異性T淋巴細(xì)胞的活化、增殖起到抑制作用，干擾T細(xì)胞表面受體的抗原信號傳導(dǎo)，引發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答負(fù)性調(diào)節(jié)，導(dǎo)致機(jī)體無法有效清除病毒，介導(dǎo)HBV慢性感染[8]。PBMC表面PD-1異常高表達(dá)水平，主要由于HBV感染病情進(jìn)展過程中受負(fù)性免疫調(diào)節(jié)機(jī)制影響，限制機(jī)體過度免疫所致肝臟組織炎癥損傷；多項(xiàng)研究證實(shí)，肝臟內(nèi)PD-1表達(dá)與肝功能炎性損傷程度、HBV感染病情進(jìn)展相關(guān)[9-11]。本研究HBV感染各組PBMC表面PD-1水平明顯升高，重度CHB組PBMC表面PD-1水平較中度CHB組、輕度CHB組高，與既往研究觀點(diǎn)相似，提示PD-1表達(dá)上調(diào)可能為HBV感染患者肝臟炎性損傷過程中的自我保護(hù)反應(yīng)，可作為臨床有效參考指標(biāo)，以輔助評估HBV復(fù)制及肝臟病理損傷情況。

Caspase為PBMC凋亡相關(guān)因子，其特異性、有效性較強(qiáng)，參與PBMC凋亡過程，于效應(yīng)期、降解期發(fā)揮重要作用，Caspase-9屬效應(yīng)性Caspase，可介導(dǎo)細(xì)胞毒性的死亡信號，參與線粒體、死亡受體凋亡通路[12]。本研究顯示，重度CHB組、中度CHB組、輕度CHB組中PBMC表面Caspase-9水平呈現(xiàn)出下降趨勢，其主要在于隨病情階段進(jìn)展，肝臟殘留功能性的上皮細(xì)胞減少，肝臟組織萎縮、局部纖維化逐漸加重，PBMC活性、數(shù)量均呈下降趨勢，其分泌Caspase-9能力亦隨之下降。Caspase-9可通過破壞肝臟上皮細(xì)胞端粒結(jié)構(gòu)，損傷肝臟上皮細(xì)胞線粒體，降低上皮細(xì)胞代謝活性，激活上皮細(xì)胞凋亡通路，加速肝臟小葉上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步造成肝功能損傷和功能障礙[13]。

AST多產(chǎn)生于肝細(xì)胞線粒體，ALT分泌于肝細(xì)胞內(nèi)，ALT、AST為HBV感染等肝臟疾病診斷常用酶學(xué)指標(biāo)，若肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，線粒體被破壞，外周血中ALT、AST大量表達(dá)[14]。本研究HBV感染各組AST、ALT、HBV-DNA水平均明顯升高，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，AST、ALT與PBMC表面PD-1呈正相關(guān)，與PBMC表面Caspase-9呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；提示PD-1、Caspase-9可作為肝損傷程度評估的參考指標(biāo)。經(jīng)ROC曲線分析顯示，PBMC表面PD-1、Caspase-9聯(lián)合檢測預(yù)測重度CHB進(jìn)展為HCC的AUC值為0.902，敏感度(90.32%)、特異度(89.47%)均較高(P<0.05)，呈現(xiàn)出較高的預(yù)測價(jià)值，可為臨床預(yù)測HBV相關(guān)性HCC提供可靠參考。

綜上所述，不同病情階段HBV感染患者PBMC表面PD-1、Caspase-9表達(dá)水平存在差異，二者表達(dá)水平與肝功能損傷程度相關(guān)，PD-1、Caspase-9聯(lián)合檢測對重度CHB進(jìn)展為HCC的預(yù)測價(jià)值較高。