楊繼濤 法憲恩

1 北大醫(yī)療魯中醫(yī)院胸心血管外科，山東省淄博市 255400； 2 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管外科

心肌梗死已經(jīng)成為全球人類死亡的頭號(hào)病因。雖然在心肌梗死診療方面取得了很大的進(jìn)步，比如新型藥物、新的再灌注方案及再血管化方式的應(yīng)用，但是成人心肌細(xì)胞再生能力很差，這就需要采取有效的措施來(lái)挽救受損的心肌細(xì)胞。

Goldman醫(yī)生首次報(bào)道將激光應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，因此他也被稱為激光醫(yī)學(xué)之父。10年后，高能CO2激光被應(yīng)用于心肌打孔，該激光有很高的能量，1～100W/cm2。CO2激光可以產(chǎn)生微孔道，不會(huì)產(chǎn)生碎屑，也不會(huì)導(dǎo)致纖維組織生成，可以讓心室腔的血液直接流入缺血的心肌[1]，即心肌打孔血運(yùn)重建技術(shù)，為那些冠狀動(dòng)脈彌漫性病變不能行冠狀動(dòng)脈介入治療或者冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)的患者提供了一種治療手段。

而低能激光發(fā)生非熱能光束，傳遞的能量不會(huì)損傷組織，但又足以引起非熱依賴的刺激效應(yīng)。低能激光照射應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究和臨床已有40余年的歷史[2]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明低能激光照射可以調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過(guò)程，比如：改善微循環(huán)，促進(jìn)傷口愈合，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)成骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞的增殖。Oron等通過(guò)大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低能激光照射可以明顯減少心肌梗死后梗死心肌面積[3]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)低能激光照射可以增加梗死心肌中ATP含量，降低線粒體損傷，顯著上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)從而保護(hù)心肌[4]。本研究通過(guò)觀察低能激光照射(Low level laser irradiation，LLLI)對(duì)大鼠心肌梗死后梗死心肌中抗氧化物質(zhì)SOD活性和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量的影響，探討低能激光照射對(duì)大鼠心肌梗死后心肌組織微環(huán)境的影響及對(duì)心肌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雌性SD大鼠120只(體質(zhì)量230～270g，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，分為假手術(shù)組(S組，n=30)，對(duì)照組(C組，n=45)和治療組(L組，n=45)。

1.2 主要儀器及試劑 10%水合氯醛溶液，SOD與MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，TY-1型激光治療儀(北京天佑科儀科技有限公司)，MS4000小動(dòng)物呼吸機(jī)HX-100E型(成都泰盟科技有限公司),RM6240-C型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)，UNICO UV-2000分光光度計(jì)，DG5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)。

1.3 模型制作方法 通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立大鼠心肌梗死模型[5]：術(shù)前30min肌肉注射青霉素10萬(wàn)單位預(yù)防感染，10%水合氯醛溶液(300g/kg)腹腔注射麻醉，備皮，氣管插管并呼吸機(jī)輔助呼吸(頻率70次/min，潮氣量3ml/100g)，胸骨左緣心臟搏動(dòng)處縱行切開(kāi)皮膚約3cm，分層于第4肋、第5肋間打開(kāi)胸腔，小心分開(kāi)心包膜，暴露心臟，以6-0 prolene線在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳間距主動(dòng)脈根部3～4mm處，以左冠狀靜脈為標(biāo)志，連同一束心肌結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，穿針后于心臟表面噴灑0.05ml 2%利多卡因注射液，待心律規(guī)整后結(jié)扎縫線，以心臟前壁局部顏色變?yōu)榘咨珵闃?biāo)志，7×17絲線逐層關(guān)胸。存活模型大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=35)和治療組(n=35)。假手術(shù)組手術(shù)操作同模型操作，但冠狀動(dòng)脈只穿線不結(jié)扎縫線(n=25)。手術(shù)結(jié)束后30℃下保溫至大鼠蘇醒，術(shù)后3d連續(xù)肌肉注射青霉素10萬(wàn)單位預(yù)防感染，飲食充足供應(yīng)。

1.4 低能激光照射 本研究采用二極管激光治療儀(波長(zhǎng)635nm，功率6mW，照射時(shí)間125s，能量密度0.96J/cm2)，大鼠心肌梗死后3周再次麻醉，于第5肋間開(kāi)胸，暴露心臟，排除心肌梗死欠明顯模型，心梗明確大鼠給予激光照射于心肌梗死部位。假手術(shù)組、對(duì)照組操作同前，但不開(kāi)通激光治療儀。操作結(jié)束后逐層關(guān)胸。

1.5 心肌組織中SOD和MDA測(cè)定 分別于二次開(kāi)胸后1h、24h、48h、72h、1周處死大鼠，取出心臟，采集各組大鼠整塊梗死的心肌組織部分，迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。標(biāo)本采集結(jié)束后，取保存的新鮮心肌組織在低溫條件下制備組織勻漿液，分別以黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA水平，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 組織病理學(xué)觀察 大鼠心肌梗死后4周 10%水合氯醛溶液麻醉，開(kāi)胸取出大鼠心臟，剪去多余的結(jié)締組織和大血管，應(yīng)用生理鹽水充分沖洗至心腔內(nèi)無(wú)血液殘留，放入10%甲醛溶液中固定，冠狀動(dòng)脈結(jié)扎線以下部分做一與房室溝平行的切面，取結(jié)扎線以下部分常規(guī)制備石蠟切片(5μm)，用于HE染色，觀察左室壁病理變化。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心梗模型的制備 制備大鼠心梗模型的成功率約為77.8%，左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎后肉眼可見(jiàn)心臟左室局部顏色變白。3周后切取心臟肉眼觀可見(jiàn)明顯的梗死區(qū)，與周邊存活心肌區(qū)別明顯。HE染色在組織學(xué)上顯示梗死區(qū)心肌組織壞死，無(wú)正常心肌結(jié)構(gòu)，與梗死周邊區(qū)存活的心肌組織區(qū)別明顯，表明心梗造模成功。

2.2 大鼠梗死心肌組織中SOD活性變化 對(duì)照組和LLLI治療組大鼠梗死心肌組織中SOD活性比假手術(shù)組明顯降低(P<0.05)，各組心肌組織中SOD活性呈現(xiàn)出術(shù)后1～48h逐漸升高，在72h后逐漸降低的趨勢(shì)。低能激光照射后SOD活性在術(shù)后1h、24h、48h比對(duì)照組明顯提高(P<0.05)，在48h達(dá)到最高，但仍較未心肌梗死的心肌組織低(P<0.05)。72h和1周時(shí)，LLLI治療組和對(duì)照組SOD活性無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 AMI二次手術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)SOD活性比較(U/mgprot，n=4～6)

2.3 大鼠梗死心肌組織中MDA含量變化 對(duì)照組和LLLI治療組大鼠梗死心肌組織中MDA含量比假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)，各組心肌組織中MDA含量呈現(xiàn)出術(shù)后1～48h逐漸降低，在72h后逐漸升高的趨勢(shì)。低能激光照射后MDA含量在術(shù)后1h、24h、48h比對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，在48h達(dá)到最低，但仍較未心肌梗死的心肌組織高(P<0.05)。72h和1周時(shí)，LLLI治療組和對(duì)照組MDA含量無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 AMI二次手術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)MDA含量比較(nmol/mgprot，n=4～6)

3 討論

活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)在血管生物學(xué)特性中發(fā)揮著重要的作用。一般認(rèn)為相對(duì)低濃度的ROS在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中充當(dāng)介質(zhì)或者調(diào)節(jié)子的作用，在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性、基因表達(dá)方面發(fā)揮重要的作用[6]，而高濃度的ROS可導(dǎo)致血管功能不全及細(xì)胞畸形生長(zhǎng)，比如血管平滑肌肥厚。隨著年齡增長(zhǎng)，或者很多病理狀態(tài)下，比如：高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、高同型半胱氨酸血癥、心力衰竭、敗血癥和阿爾茨海默病等[7]，血管中的氧自由基水平是明顯增加的。機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定的氧自由基水平依賴于其產(chǎn)生速度和各種超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SODs)濃度。SODs可以歧化超氧化物加氧生成過(guò)氧化氫，具有多種生物學(xué)作用[8]，比如：保護(hù)細(xì)胞免受超氧化物介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；保護(hù)一氧化氮(Nitric Oxide,NO)及NO介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。NO是重要的血管舒張物質(zhì)，其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)在細(xì)胞生物功能中發(fā)揮重要的作用。

ROS還可以和其他的生物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生新的物質(zhì)，比如和脂類反應(yīng)生成MDA。這個(gè)現(xiàn)象被稱為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[9]，反過(guò)來(lái)，這也是ROS的主要來(lái)源。MDA對(duì)機(jī)體細(xì)胞有多種危害[10]，可以通過(guò)降低復(fù)合體Ⅰ的活性損傷細(xì)胞線粒體，還可以改變多巴胺能代謝，甚至和細(xì)胞修復(fù)蛋白相互作用，導(dǎo)致基質(zhì)修復(fù)系統(tǒng)受損，誘發(fā)基因突變的發(fā)生。因此，血漿MDA濃度不僅可以反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，還可以反映氧化反應(yīng)的嚴(yán)重程度及機(jī)體受氧化應(yīng)激的損傷程度。

心肌梗死后心肌缺血、缺氧以及心肌缺血再灌注導(dǎo)致心肌組織中氧自由基堆積，誘發(fā)細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸氧化而形成的MDA增加，使得心肌細(xì)胞受到更嚴(yán)重的損傷。因此MDA含量可以反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度。SOD作為機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要酶，可以清除氧自由基，對(duì)抗MDA對(duì)心血管的損傷作用，SOD活力越高，則清除氧自由基的能力越強(qiáng)，對(duì)心血管的保護(hù)作用的效果越顯著。故SOD和MDA可動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)氧自由基的防治效果。

低能激光照射是一種無(wú)創(chuàng)、無(wú)顯著危害的物理治療方法，主要通過(guò)所謂的“光生物刺激”效應(yīng)而非“熱效應(yīng)”發(fā)揮作用[11]。Ad N等人研究發(fā)現(xiàn)，LLLI可以使心肌梗死面積減少達(dá)65%，顯著減少心肌組織的丟失[3]。Hana Tuby等發(fā)現(xiàn)，LLLI可以顯著上調(diào)梗死心肌組織中VEGF和iNOS的表達(dá)，從而有效的發(fā)揮心肌保護(hù)作用及促進(jìn)血管再生[4]。國(guó)內(nèi)胡盛壽等研究表明LLLI在照射后急性期內(nèi)可以刺激?！奘杉?xì)胞集落刺激因子的表達(dá)和下調(diào)fractalktin表達(dá)，從而減少白細(xì)胞聚集，促進(jìn)自身心肌修復(fù)，更好地保護(hù)損傷的心肌組織[12]，另外還發(fā)現(xiàn)，LLLI可以有效促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)制、分泌及向心肌組織分化[13]。然而，目前不同類型的低能激光的最佳治療能量密度沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。既往研究發(fā)現(xiàn)，低能激光治療缺血心肌最佳的功率密度范圍為5～15mW/cm2，在治療各組織疾病和臨床應(yīng)用中最佳的能量密度為1～4J/cm2[14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，能量密度在1J/cm2的LLLI最有利于缺血性心臟病的治療[15]，同時(shí)，Hana Tuby等研究顯示，低能激光以能量密度為0.96J/cm2直接照射梗死心肌組織可以顯著上調(diào)梗死心肌組織中VEGF和iNOS的表達(dá)[4]，從而有效發(fā)揮心肌保護(hù)作用及促進(jìn)血管再生，減少心肌梗死面積。因此，本研究采用輸出功率為6mW，照射時(shí)間為125s，功率密度為6.37mW/cm2，能量密度為0.96J/cm2。

本研究表明心肌梗死后心肌組織中SOD活性明顯降低，MDA含量增加，采用低能激光直接照射梗死后心肌組織后1h，即可以顯著增加SOD活性，減少M(fèi)DA含量，明顯改善了心肌梗死后心肌組織不良的微環(huán)境，但是這種顯著性差異在72h和1周時(shí)不再具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低能激光的“光生物刺激”的確切機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為低能激光通過(guò)作用于線粒體呼吸鏈中的細(xì)胞色素C等光受體進(jìn)而引起氧自由基的輕度、短暫升高，進(jìn)一步激發(fā)Ca2+內(nèi)流，通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)通道，影響細(xì)胞活性，發(fā)揮生物學(xué)作用[6，8]。本研究發(fā)現(xiàn)，LLLI對(duì)SOD活性和MDA含量的影響在48h達(dá)到最大，72h時(shí)已消失，這說(shuō)明在LLLI后1～48h這個(gè)時(shí)間段內(nèi)，LLLI明顯抑制了自由基的產(chǎn)生，降低了氧自由基對(duì)細(xì)胞的損害，充分發(fā)揮了心肌保護(hù)作用。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells)可以明顯減少心肌梗死面積，促進(jìn)血管生成，改善心肌梗死后病理改變，提高心肌梗死后心臟功能，但移植后梗死區(qū)極低的存活率嚴(yán)重限制了BMSCs的應(yīng)用，梗死后心肌組織炎癥反應(yīng)、缺血等“不良”移植微環(huán)境是導(dǎo)致移植細(xì)胞高死亡率的主要機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)LLLI后1～48h時(shí)間段內(nèi)LLLI可以明顯減少梗死心肌組織中氧自由基含量，減輕氧自由基對(duì)心肌組織的損傷，具有心肌保護(hù)作用，另外，LLLI也可以促進(jìn)梗死心肌組織中VEGF和iNOS的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)干細(xì)胞的定植和復(fù)制提供了一個(gè)良好的微環(huán)境，也為增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死提供了一種簡(jiǎn)單有效的干預(yù)方法。

LLLI發(fā)揮生物學(xué)的具體機(jī)制尚未完全清楚，已有研究顯示，LLLI可以改變梗死心肌中細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)。受損心肌中釋放的細(xì)胞因子在心肌修復(fù)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[16-17]。細(xì)胞因子蛋白陣列系統(tǒng)可以檢測(cè)LLLI后心肌中細(xì)胞因子的變化，以探查受損心肌的細(xì)胞因子變化。結(jié)果顯示LLLI可促進(jìn)生成白介素-4(Interleukin-4,IL-4)和粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，抑制趨化因子-3(CINC-3)和曲動(dòng)蛋白(fractalkine)的產(chǎn)生[18]。而GM-CSF可以驅(qū)動(dòng)BMSCs至梗死心肌中[19]。另一研究報(bào)道冠脈內(nèi)或皮下應(yīng)用GM-CSF可以改善冠心病病人的側(cè)支血流[20]。這些均顯示LLLI可以改善干細(xì)胞的生存環(huán)境，促進(jìn)GM-CSF表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)側(cè)支循環(huán)生成。另外，曲動(dòng)蛋白在白細(xì)胞聚集中發(fā)揮作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)組織局部的炎癥反應(yīng)[21]。降低曲動(dòng)蛋白濃度可以抑制梗死心肌組織中的白細(xì)胞聚集，減輕炎癥反應(yīng)，改善移植干細(xì)胞的存活率。因此，LLLI可以通過(guò)刺激GM-CSF表達(dá)，抑制曲動(dòng)蛋白對(duì)梗死心肌有良好的保護(hù)作用。這與本研究結(jié)果具有相同的同一性。這可能是LLLI發(fā)揮生物學(xué)作用的一方面，其確切的作用機(jī)制尚需新的平臺(tái)技術(shù)，比如蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)，從分子學(xué)角度進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，低能激光照射可以降低大鼠心肌組織中氧自由基含量，從而對(duì)梗死后心肌組織有保護(hù)作用。