莫房德，姚妮，公方強(qiáng)，施麗，莫麗芬，牛向麗

隨著冷凍復(fù)蘇技術(shù)的不斷發(fā)展，配子(精子和卵子)和胚胎的冷凍保存及復(fù)蘇成為人類輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)一項(xiàng)重要的衍生技術(shù)。胚胎的冷凍保存和復(fù)蘇技術(shù)減少了促排卵次數(shù)和胚胎的浪費(fèi)，減少了患者卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)的發(fā)生，從而增加胚胎移植的機(jī)會(huì)[1-2]。卵母細(xì)胞冷凍保存在生殖醫(yī)學(xué)及生育力儲存領(lǐng)域是一項(xiàng)值得探討的潛力技術(shù)。女性隨著年齡的增加，生育力急劇降低、自然流產(chǎn)率上升，對卵母細(xì)胞冷凍保存的需求已經(jīng)顯著增加[3-4]，卵母細(xì)胞冷凍保存不僅可以為接受放療、化療或由于其他病理原因而不能或者延緩生育的女性提供妊娠的機(jī)會(huì)，為患者儲存多余的卵母細(xì)胞，還可以用于卵子捐贈(zèng)計(jì)劃，給失去卵巢功能的患者提供妊娠的機(jī)會(huì)[5-6]。

液氮應(yīng)用于生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，是配子及胚胎的主要冷凍貯存媒介。精子、卵母細(xì)胞以及胚胎需要一直在液氮罐中冷凍貯存，但是液氮罐一旦發(fā)生泄漏，將導(dǎo)致罐內(nèi)溫度迅速上升，從而打破細(xì)胞的玻璃化狀態(tài)，對胚胎造成不可逆的傷害。謝敬田等[7]研究發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，液氮儲存罐內(nèi)的液氮液面下降，該區(qū)域的溫場特性會(huì)更差，溫度會(huì)更高，不利于樣品的長期保存。因此，加強(qiáng)監(jiān)測液氮罐內(nèi)液氮揮發(fā)量，保證液氮罐內(nèi)胚胎的安全，是胚胎冷凍保存的重要環(huán)節(jié)。目前尚缺少液氮罐在失真空后樣本保存效果的研究，本研究試圖通過模擬液氮罐發(fā)生泄漏后，液氮罐內(nèi)溫度對精子、卵母細(xì)胞以及胚胎影響的規(guī)律，進(jìn)而評估液氮罐發(fā)生泄漏后對配子和胚胎的影響，為生物樣本保存提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與研究方法

1.1 主要試劑與儀器

試劑：玻璃化冷凍液(KITAZATO日本)，玻璃化解凍液(KITAZATO日本)，緩沖輸卵管液(Quinn's美國)，SPS(Quinn's美國)，卵裂輸卵管液(Quinn's 美國)，精子冷凍保護(hù)劑(SAGE美國)。 儀器：IVF工作站(ESCO新加坡)，倒置顯微鏡(Nikon日本)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo美國)，精子分析系統(tǒng)(CASA 西班牙)，液氮罐(MVE美國)。

1.2 研究方法與分組

1.2.1 液氮罐分組 A罐為部分失真空液氮罐，使用過程液氮罐表面有水珠、蓋子周圍有結(jié)冰表示液氮罐已經(jīng)破損，為部分失真空。B罐為完全失真空液氮罐，表面進(jìn)行了打孔處理。C罐為完好液氮罐。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及卵母細(xì)胞的獲取 參考張超凡等[8]的實(shí)驗(yàn)方法，將收集到的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體用于體外受精試驗(yàn)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至卵裂期，用于冷凍試驗(yàn)，將去顆粒細(xì)胞后的卵母細(xì)胞用于冷凍試驗(yàn)。

1.2.3 精子采集 取10只10周齡雄鼠，采用頸椎脫臼法處死，無菌條件下取出附睪尾，于1023+10%SPS中沖洗3次，用眼科鑷輕輕擠出精子，收集精子懸液，用梯度離心處理精液，取其沉淀，用受精液上游精子，用CASA精子分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)精子活力及濃度。

1.2.4 精子、卵母細(xì)胞、胚胎冷凍 精子冷凍：上游處理后精子分80份，在精子懸浮液中逐漸加入等體積的精子冷凍保護(hù)劑，邊加邊混勻，用微量加樣器吸取30 μL吸入2 mL的冷凍管(CORNING430659美國)，先存于4℃冰箱10 min,再-20℃冷凍10 min，再在液氮面上5 min后投入液氮保存，凍存至少24 h后從液氮中取出，立即將冷凍管置于37℃恒溫水浴箱中復(fù)蘇5 min。用CASA精子分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)復(fù)蘇后活動(dòng)精子數(shù)目、精子活動(dòng)率。卵母細(xì)胞與胚胎玻璃化冷凍解凍：本次實(shí)驗(yàn)卵母細(xì)胞與胚胎玻璃化冷凍參考本中心的冷凍解凍方法[9-10]。

1.2.5 剩余液氮量與溫度變化測定 用凱豐電子稱(型號A17-LCD)對三組液氮罐(型號XC 47/11)稱重，每隔1 h檢測液氮罐重量，同時(shí)用衡星數(shù)字溫度計(jì)(型號LCD-06058)記錄溫度變化。連續(xù)監(jiān)測72 h，記錄三組液氮罐重量及溫度變化。

1.2.6 各類樣本存活率分析 根據(jù)以上液氮揮發(fā)以及溫度變化情況，把用冷凍小鼠的精子、卵母細(xì)胞、胚胎放于完全失真空的液氮罐(B)，根據(jù)完全失真空的液氮罐的溫度變化的情況來確定解凍時(shí)機(jī)，在溫度上升到-180℃時(shí)解凍第一組精子、卵母細(xì)胞以及胚胎，之后每隔1 h解凍一組，共分4組解凍，觀察各個(gè)時(shí)間段精子、卵子、胚胎的存活狀態(tài)。

1.2.7 精子冷凍復(fù)蘇效果的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 采用精子冷凍復(fù)蘇率作為精子冷凍復(fù)蘇效果，公式如下：精子冷凍復(fù)蘇率=(復(fù)蘇后活動(dòng)率/冷凍前活動(dòng)率)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組液氮罐液氮揮發(fā)量的變化情況

72 h內(nèi)，A罐、B罐、C罐相比較，B罐液氮揮發(fā)更快，A罐液氮揮發(fā)8.25 kg，B罐液氮揮發(fā)31.9 kg，C罐液氮揮發(fā)1.15 kg；26 h內(nèi)，A罐、B罐、C罐相比較，B罐液氮揮發(fā)的更快，A罐液氮揮發(fā)4.2 kg，B罐液氮揮發(fā)31.7 kg，C罐液氮揮發(fā)0.4 kg。詳見下頁圖1。

圖1 各組液氮罐液氮揮發(fā)量的變化情況

2.2 各組液氮罐內(nèi)溫度的變化情況

72 h內(nèi)，A罐、B罐、C罐相比較，B罐溫度上升到25℃，A罐和C罐溫度無變化，均為-198.8℃；26 h內(nèi)，A罐、B罐、B罐比較，B罐溫度上升到-72℃，而A罐和C罐溫度仍然是-198.8℃。詳見下頁圖2。

圖2 各組液氮罐內(nèi)溫度的變化情況

2.3 各組精子、卵母細(xì)胞、胚胎解凍后存活率的變化情況

各組精子解凍后，復(fù)蘇率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。第1、2、3組卵母細(xì)胞解凍后，存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而第4組卵母細(xì)胞冷凍復(fù)蘇率顯著低于第1、2、3組(P<0.05)，卵母細(xì)胞存活率僅為61.11%，見表2。第1、2、3組卵裂期胚胎解凍后，存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而第4組卵裂期胚胎冷凍復(fù)蘇率顯著低于第1、2、3組(P<0.05)，卵裂期胚胎存活率僅為64%，見表3。

表1 完全失真空液氮罐解凍各組精子復(fù)蘇率的比較

表2 完全失真空液氮罐解凍各組卵母細(xì)胞存活比較

表3 完全失真空液氮罐解凍各組卵裂期胚胎存活比較

表4 液氮罐與液氮揮發(fā)量、溫度變化關(guān)系

3 討論

隨著輔助生殖的發(fā)展，越來越多的卵母細(xì)胞以及胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍并儲存在液氮罐里。卵母細(xì)胞具有表面積與體積比小、含水量高和存在減數(shù)分裂紡錘體等特點(diǎn)，故成熟卵母細(xì)胞是最難成功冷凍的細(xì)胞之一。卵母細(xì)胞冷凍的影響因素包括：冷凍保護(hù)劑對卵母細(xì)胞造成滲透損傷和冷凍過程中胞內(nèi)冰晶形成造成的機(jī)械損傷[11]。以上因素造成的卵母細(xì)胞微絲、微管、中間絲等細(xì)胞骨架的損傷，透明帶硬化破裂，皮質(zhì)顆粒外排，細(xì)胞膜、線粒體等超微結(jié)構(gòu)破壞，紡錘體損傷、染色體畸變等，都會(huì)對卵母細(xì)胞的存活率、受精率、妊娠率以及子代安全性造成直接影響。

卵母細(xì)胞玻璃化冷凍能減少對細(xì)胞的物理傷害，但是細(xì)胞存活率的高低不是單一因素造成的，是每一個(gè)環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果。發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變的卵母細(xì)胞以及胚胎，一直保在液氮中，當(dāng)需要恢復(fù)其活性時(shí)，必須復(fù)溫到環(huán)境溫度，但在復(fù)溫過程中卻極其容易發(fā)生重結(jié)晶現(xiàn)象[12]。有研究表明，玻璃化后胚胎的存活能力取決于細(xì)胞脫水的程度和復(fù)蘇時(shí)升溫的速率,在復(fù)蘇過程中使用超快速升溫獲得小鼠卵母細(xì)胞和胚胎的高冷凍存活率[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，液氮罐失真空后復(fù)溫過程對精子損傷影響較小，對卵母細(xì)胞和卵裂期胚胎影響較大，造成了第4組較多的卵母細(xì)胞和卵裂期胚胎退化(見下頁圖3、圖4)。這可能是因?yàn)?，液氮罐失真空?dǎo)致的復(fù)溫，升溫速率是緩慢的，卵母細(xì)胞和胚胎未能快速通過-120℃到-35℃的危險(xiǎn)階段，導(dǎo)致重結(jié)晶對卵母細(xì)胞和胚胎的損傷而影響后續(xù)的發(fā)育能力[14-15],甚至造成細(xì)胞死亡。因此，在使用液氮罐的過程中要經(jīng)常檢查，可以用肉眼觀測，也可以用手觸摸外殼，若發(fā)現(xiàn)蒸發(fā)量突然異常增多或外殼金屬表面突然結(jié)霜，說明液氮存在失真空可能，應(yīng)立即停止使用[16]。

圖3 完全失真空液氮罐解凍卵母細(xì)胞第4組(-63℃)

圖4 完全失真空液氮罐解凍卵裂期胚胎第4組(-63℃)

本實(shí)驗(yàn)通過比較A罐、B罐、C罐之間的液氮揮發(fā)量，推測出液氮罐損傷狀況及其嚴(yán)重程度，從上頁表4觀察可知，當(dāng)液氮罐24 h內(nèi)揮發(fā)0.4～0.5 kg，屬于正常揮發(fā)量，當(dāng)液氮罐24 h內(nèi)揮發(fā)4～5 kg，屬于預(yù)警值，說明液氮罐已經(jīng)部分失真空，必須立即停止使用。當(dāng)液氮罐24 h內(nèi)揮發(fā)30 kg，說明液氮罐已經(jīng)完全失真空，此時(shí)液氮罐內(nèi)溫度已經(jīng)上升至-158℃，罐內(nèi)卵母細(xì)胞及胚胎可能已經(jīng)發(fā)生了不可逆性損傷。本研究不足之處在于，完全失真空液氮罐內(nèi)溫度的變化確定解凍時(shí)機(jī)，不確定液氮罐內(nèi)溫度從-196℃上升至-180℃時(shí)配子(精子和卵子)和胚胎是否已經(jīng)造成損傷。同時(shí)，對于各組解凍存活的卵母細(xì)胞和胚胎，僅從形態(tài)學(xué)上觀察其存活狀態(tài)，難以確定是否已經(jīng)造成卵母細(xì)胞和胚胎的微絲、微管、中間絲等細(xì)胞骨架的損傷以及細(xì)胞膜、線粒體等超微結(jié)構(gòu)破壞。有關(guān)卵母細(xì)胞及胚胎在液氮罐內(nèi)溫度的臨界值及在該溫度儲存多長時(shí)間才會(huì)對卵母細(xì)胞和胚胎造成損傷，有待進(jìn)一步研究。

綜上，B罐26 h時(shí)液氮揮發(fā)了31.7 kg，這是揮發(fā)的最大值，說明B罐內(nèi)液氮已經(jīng)完全揮發(fā)，而此時(shí)B罐內(nèi)的溫度已經(jīng)上升到-72℃。另外，本研究的復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)是根據(jù)溫度來復(fù)蘇卵母細(xì)胞以及卵裂期胚胎并計(jì)算其的存活率，復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)的第4組溫度為-63℃與B罐內(nèi)的-72℃為相近溫度，而此刻的溫度會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞以及卵裂期胚胎不再是玻璃化狀態(tài)，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞以及卵裂期胚胎造成損傷。故本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為液氮罐完全失真空后26 h內(nèi)溫度迅速上升，對精子損傷影響較小，對卵母細(xì)胞與胚胎會(huì)造成不可逆的損傷。