趙心宇，王恩琴，盧韜，張麗紅

1.紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江紹興 312000；2.紹興市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，浙江紹興 312000

最新癌癥統(tǒng)計報告顯示，肺癌是全球癌癥死亡的最主要原因，每天有超過350 人死于肺癌，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占85%[1]。NSCLC 惡性程度高、進展快，早期缺乏典型的臨床癥狀，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)大多為中晚期，治療手段和療效均有限。我國NSCLC 患者的5 年生存率僅為19.7%[2]，因此，研究NSCLC 侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機制，對發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，改善患者預(yù)后具有重要意義。α-烯醇化酶1（alpha-enolase 1，ENO1）是烯醇化酶的3 種亞型之一，屬于糖酵解過程中重要的限速酶，能夠催化2-磷酸甘油酸脫水生成磷酸烯醇式丙酮酸。近年來多個研究發(fā)現(xiàn)ENO1 在多種類型腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中均具有重要作用。既往研究顯示在肺癌患者的癌組織和外周血中，ENO1 表達升高，且對肺癌患者早期診斷具有一定價值[3]，但ENO1 對NSCLC 的生物學(xué)功能有何影響尚不明確。本研究旨在探討ENO1 對NSCLC 侵襲轉(zhuǎn)移和增殖的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人NSCLC細胞株A549、H460（中國科學(xué)院細胞庫，上海）；ENO1、GAPDH單克隆抗體及抗兔抗體（Abcam公司，美國）；RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒（博士德生物工程有限公司，武漢）；ENO1-小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）（銳博生物科技有限公司，廣州）；Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑、CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，上海）；ENO1、內(nèi)參GAPDH引物（生工生物股份有限公司，上海）；One Step SYBR RT-qPCR Kit（Takara公司，日本）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PMSF（北京索萊寶生物科技有限公司）；Biolonase核酸酶（拜朗生物科技有限公司，上海）；蛋白Marker（Invitrogen公司，美國）；Transwell小室（Corning公司，美國）。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://gdc-portal.nci.nih.gov/）分析ENO1在肺腺癌和肺鱗癌中的表達差異及與患者腫瘤分期之間的關(guān)系；Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/）用于分析肺腺癌和肺鱗癌中ENO1表達水平對患者生存率的影響；利用GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的GSE30219數(shù)據(jù)集分析272 例NSCLC患者的ENO1相對表達量，探討ENO1與NSCLC臨床病理指標的相關(guān)性。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將H460、A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱；當細胞處于對數(shù)生長期時接種于6孔板中，24h后細胞融合度達70%～90%，利用Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染。實驗分為實驗組（siRNA干擾）及對照組。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)

利用RNA提取試劑盒提取上述轉(zhuǎn)染24h后細胞的全部RNA，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）一步法驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.5 蛋白質(zhì)印跡實驗

提取轉(zhuǎn)染48h后的A549及H460細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，煮沸變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2h，加入一抗（ENO1、GAPDH）后4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2h，ECL顯色后曝光測試。

1.6 CCK-8 實驗

收集各組細胞并按2×104個/孔（100μl）的密度接種至96孔板中，分別在鋪板后24h、48h、72h，向各孔加入10μl CCK-8檢測液，繼續(xù)培養(yǎng)2h，酶標儀檢測各孔450nm吸光度（A450）。

1.7 劃痕實驗

取對數(shù)期細胞均勻鋪在6孔板中，進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染結(jié)束待細胞生長密度至90%左右，用10μl無菌移液槍槍頭在6孔板中劃十字劃痕，磷酸鹽緩沖液清洗3次，換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在0h、24h、48h鏡下觀察劃痕的改變情況并拍照記錄。

1.8 Transwell 侵襲實驗

用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基以1 ∶8稀釋Matrigel膠基質(zhì)，將Transwell小室置于24孔板中，取50μl稀釋膠加至小室上室面，37℃孵育3h。取各組對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為1.5×105/L，每孔加入100μl細胞懸液至Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48h后，用4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染液染色，200倍顯微鏡視野下隨機選取5個視野拍照，Image J軟件進行細胞計數(shù)并分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料用例數(shù)（百分率）[n（%）]進行描述，組間比較采用χ2檢驗，計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析

2.1.1 ENO1在NSCLC的表達及其與TNM分期的關(guān)系從TCGA數(shù)據(jù)庫得到肺鱗癌（502例癌組織及49例正常組織）和肺腺癌（535例癌組織和59例正常組織）中ENO1的表達量，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，ENO1在肺鱗癌及肺腺癌中的表達均顯著升高（P<0.001），見圖1A、F。肺鱗癌中ENO1表達水平與分期無關(guān)。Ⅱ～Ⅳ期肺腺癌中ENO1 的表達水平顯著高于Ⅰ期（P<0.001），見圖1B，N1～N3期肺腺癌中ENO1的表達水平顯著高于N0期（P<0.001），見圖1D。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中ENO1在NSCLC中的表達

2.1.2 數(shù)據(jù)庫分析ENO1與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫探索ENO1表達水平與患者總生存之間的關(guān)系，結(jié)果顯示無論是肺腺癌還是肺鱗癌，ENO1的表達水平越高，患者預(yù)后越差（P<0.05），見圖2。

圖2 ENO1表達水平與肺腺癌、肺鱗癌患者的預(yù)后關(guān)系

2.1.3 數(shù)據(jù)庫分析ENO1與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系 分析GEO數(shù)據(jù)庫中272例NSCLC患者的臨床資料，結(jié)果顯示，ENO1表達水平與患者組織學(xué)分型及是否復(fù)發(fā)顯著相關(guān)（P<0.001），與患者的TNM分期、年齡、性別及是否復(fù)發(fā)無相關(guān)性（P>0.05），見表1。

表1 ENO1 與NSCLC 患者臨床特征的相關(guān)性（例）

2.2 干擾ENO1 表達效果驗證

應(yīng)用RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡法驗證ENO1干擾效果，結(jié)果顯示A549、H460細胞轉(zhuǎn)染si-ENO1后，mRNA和蛋白相對表達量均低于對照組（P<0.001），見圖3。

圖3 siRNA 干擾ENO1 效果驗證

2.3 干擾ENO1 表達對NSCLC 細胞增殖能力的影響

CCK-8 實驗結(jié)果顯示，A549、H460 細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后，48h 及72h 的OD 值均顯著低于對照組（P<0.05），見圖4。

圖4 CCK-8 實驗檢測細胞增殖能力

2.4 干擾ENO1 表達對NSCLC 細胞遷移能力的影響

劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，干擾ENO1 表達后A549 及H460 細胞遷移能力均減弱（P<0.05），見圖5。

圖5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力(×100)

2.5 干擾ENO1 表達對NSCLC 細胞侵襲能力的影響

Transwell 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，干擾ENO1 表達后A549 及H460 細胞體外侵襲能力均減弱（P<0.05），見圖6。

圖6 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力

3 討論

ENO1 又稱為2-磷酸-D-甘油水解酶，主要存在于細胞膜和細胞質(zhì)中，具有催化糖酵解過程、維持線粒體膜穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)信號通路、促進纖溶酶形成等多種生物學(xué)功能[4-7]。ENO1 能夠促使惡性腫瘤細胞發(fā)生Warburg 效應(yīng)，使其通過有氧糖酵解途徑利用葡萄糖，同時降低線粒體內(nèi)的有氧磷酸化，讓腫瘤細胞實現(xiàn)無限增殖[8-10]。此外，定位于細胞膜表面的ENO1 能夠結(jié)合并活化纖溶酶原，使腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移；還可增強單核巨噬細胞的浸潤能力，其機制可能是通過Notch 信號通路進而控制c-myc 癌蛋白的表達，參與腫瘤形成[11]。研究表明，ENO1 的表達水平與多種惡性腫瘤的預(yù)后顯著相關(guān)[12-13]。Jiang 等[14]發(fā)現(xiàn)外泌體來源的ENO1 可通過上調(diào)整合素α6β4 的表達，實現(xiàn)FAK/Src-p38MAPK 途徑的激活從而促進肝細胞癌的生長和轉(zhuǎn)移。而在胃癌細胞中，ENO1 主要通過調(diào)節(jié)Akt 信號通路促進腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。此外，在乳腺癌、膀胱癌、大腸癌中均發(fā)現(xiàn)ENO1 能夠促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[12,16-17]。課題組前期研究顯示，ENO1 在肝癌組織中高表達，且具有促進肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用[18]。這些結(jié)果表明ENO1 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

本研究通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)ENO1在NSCLC 組織中高表達，TNM 分期結(jié)果顯示ENO1在肺腺癌中與患者分期有關(guān)，且僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，ENO1 的高表達與肺腺癌及肺鱗癌患者的預(yù)后不良有關(guān)，ENO1 的表達水平與患者組織學(xué)分型及是否復(fù)發(fā)顯著相關(guān)。但課題組前期研究結(jié)果顯示肺癌患者血清和組織中ENO1 的表達與性別、組織學(xué)分型無關(guān)，且Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者ENO1 表達也高于Ⅲ～Ⅳ期患者，兩者結(jié)論不符，分析原因可能是課題組前期檢測樣本量較少，且以Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者為主，病理類型大多為肺腺癌，缺少其他病理類型的樣本，還有待加大樣本量進一步證實。本研究利用CCK-8實驗、劃痕實驗、Transwell 實驗證實，干擾ENO1表達后NSCLC 細胞增殖、遷移、侵襲能力減弱，提示ENO1 具有促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

本研究也存在不足之處。NSCLC 是除小細胞肺癌以外、所有來源于肺上皮的各種類型癌癥的集合體，常見類型有鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌。但本實驗使用的A549、H460 細胞株分別為肺腺癌和大細胞肺癌，對于肺鱗癌及其他少見類型的NSCLC 細胞系尚未驗證ENO1 的生物學(xué)功能，未來將進一步增加相應(yīng)的細胞系進行研究。另外，對ENO1 促進NSCLC 侵襲轉(zhuǎn)移的作用機制研究不夠深入，ENO1在腫瘤免疫方面充當何種角色，是否能作為NSCLC的一種新型免疫治療位點，其具體作用機制又是如何，這也是未來研究的主要方向。

綜上所述，ENO1在NSCLC中高表達，且其表達水平與患者預(yù)后相關(guān)，ENO1具有促進NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的作用，有可能成為新的NSCLC生物標志物及治療靶點。