林偉強(qiáng)， 袁惠玲， 溫潤(rùn)耀， 葉建森， 張愛玲

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞醫(yī)院/東莞市人民醫(yī)院乳腺科， 廣東 東莞 523000)

乳腺癌是女性高發(fā)惡性腫瘤，其中以浸潤(rùn)性乳腺癌(invasive breast carcinoma,IBC)多見，因IBC容易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，有關(guān)其研究備受重視[1]。P120連環(huán)蛋白(catenin,P120ctn)為連環(huán)蛋白家族成員之一，可參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、黏附作用等過程，其異常表達(dá)與惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。p53基因是人體重要的抑癌基因，正常情況下其編碼的野生型p53蛋白可通過誘導(dǎo)凋亡、幫助基因修復(fù)參與腫瘤抑制過程，但突變型p53蛋白則喪失誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力，與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，因此p53蛋白在惡性腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)估中有一定應(yīng)用[3]。細(xì)胞角蛋白5/6(Cytokeratin5/6,CK5/6)是一種基底細(xì)胞角蛋白，與上皮細(xì)胞的增殖分化關(guān)聯(lián)密切，在維持上皮組織連續(xù)性、完整性中起重要作用[4]。新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NAC)在惡性腫瘤治療中十分普遍，其主要目的在于縮小腫瘤病灶、殺滅轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，從而為后期局部手術(shù)或放療奠定良好基礎(chǔ)，早期預(yù)測(cè)NAC療效可為臨床診療方案制定提供參考[5]。為此，本研究采用免疫組化法分析了IBC患者癌組織P120ctn、p53、CK5/6表達(dá)情況，旨在探究其與臨床病理特征、NAC療效關(guān)系，從而為后期IBC患者預(yù)后評(píng)估及診療方案制定提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料：回顧性分析2018年10月至2021年10月120例女性IBC患者臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)穿刺活檢或術(shù)后病理明確IBC診斷，即顯微鏡下見癌細(xì)胞侵入乳腺導(dǎo)管、基底膜和間質(zhì)的乳腺癌類型；②入院前無任何抗乳腺癌治療；③適合行NAC者，即臨床分期ⅡA、ⅡB、ⅢA(僅T3、N1、M0)希望縮小腫塊、降期保乳者，或臨床分期ⅢA(不含T3、N1、M0)、ⅢB、ⅢC期者，且術(shù)前均接受規(guī)范NAC；④留存足夠行免疫組化分析[一般厚度0.3cm、面積(1.0～1.5)cm×(1.0～1.5)cm]的癌組織、癌周組織標(biāo)本；⑤臨床病理資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤復(fù)發(fā)者或其他部位惡性腫瘤轉(zhuǎn)移者；②入組時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；③合并免疫疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病、急慢性感染等其他嚴(yán)重疾病者；④未按規(guī)定完成NAC治療者；⑤特殊類型乳腺癌或男性乳腺癌患者。120例患者年齡28～79歲，平均(55.74±11.35)歲；乳腺癌分子分型Luminal A型[雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptormPR)陽性，人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)陰性，腫瘤增殖抗原Ki-67<14%]27例，Luminal B型(ER陽性和/或PR陽性，HER2陰性、Ki67≥14%；或ER陽性和/或PR陽性，HER2陽性，無論Ki67表達(dá)如何)62例，HER-2過表達(dá)型(ER陰性、PR陰性、HER2陽性)19例，三陰性(ER陰性、PR陰性、HER2陰性)乳腺癌12例；臨床分期：Ⅱ期56例，Ⅲ期64例。

1.2方 法

1.2.1臨床資料收集：收集患者臨床病理資料，包括年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤直徑、分子分型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等。

1.2.2免疫組化

1.2.2.1主要試劑和儀器：P120ctn、p53、CK5/6鼠抗人單克隆抗體及二抗試劑盒均購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司；EDTA抗原修復(fù)液、DAB顯色劑購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；MY2300型全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)購(gòu)自上海精密儀器儀表有限公司，Olympus BX53光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海普赫光電科技有限公司。

1.2.2.2免疫組化檢測(cè)：組織標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)制作4μm厚石蠟切片，免疫組化染色采用EnVision二步法，主要步驟：二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，EDTA法高溫高壓抗原修復(fù)，3%H2O2行過氧化氫酶阻斷，1%BSA封閉非特異性抗原，滴加一抗(P120ctn、p53、CK5/6鼠抗人單克隆抗體，4℃孵育過夜)，滴加二抗(常溫孵育1h)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片；切片均設(shè)陽性(已知陽性標(biāo)本)和陰性對(duì)照(PBS緩沖液代替一抗)。

1.2.2.3結(jié)果判定：先于低倍鏡下觀察染色，找到合適視野后，隨機(jī)選取5個(gè)視野(≥100個(gè)細(xì)胞)，p53、CK5/6于400倍鏡下觀察染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞表達(dá)(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)，其中p53以細(xì)胞核著色為陽性，CK5/6以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)著色為陽性，A染色強(qiáng)度分為不著色(0分)、淺黃色(1分)、棕色或黃色(2分)、深棕色或棕褐色(3分)，B陽性細(xì)胞表達(dá)可分為<5%(0分)、5～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)、>75%(4分)；最后積分取5個(gè)視野平均值，其中A×B≥2分為陽性表達(dá)，否則為陰性表達(dá)。P120ctn觀察細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)染色情況，正常情況下P120ctn定位于細(xì)胞膜，著色后呈棕黃色，正常細(xì)胞P120ctn膜陽性細(xì)胞率>75%，而腫瘤細(xì)胞P120ctn膜表達(dá)下降、細(xì)胞質(zhì)表達(dá)升高，當(dāng)P120ctn胞質(zhì)比率>10%時(shí)視為陽性表達(dá)。結(jié)果判斷由2名均有具有中級(jí)及以上職稱病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行診斷，結(jié)論不一致時(shí)協(xié)商達(dá)成一致。

1.2.3NAC方案及療效評(píng)價(jià)：參考2019年版《中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范》[5]行NAC治療，均采用TAC方案，即多西他賽(75mg/m2，靜滴，d1)+多柔比星(50mg/m2，靜滴，d1)+環(huán)磷酰胺(500mg/m2，靜滴，d1)方案，以21d為1個(gè)周期，共6個(gè)周期，各周期均采用粒細(xì)胞集落刺激因子支持。于第2個(gè)周期末評(píng)估NAC療效，采用磁共振檢查，參考實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1版[6]分為完全緩解(complete remission,CR)、部分緩解(partial response,PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease,SD)和疾病進(jìn)展(progression disease,PD)，統(tǒng)計(jì)有效率，即(PR+CR)/總例數(shù)×100%。PR患者繼續(xù)行2個(gè)周期NAC，然后于3周內(nèi)行手術(shù)治療，CR、SD、PD患者改行手術(shù)，其中CR、PR者手術(shù)后繼續(xù)完成原化療方案；SD、PD術(shù)后更換其他化療方案。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS24.0軟件，用n(%)表示計(jì)數(shù)資料，比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)法；影響因素分析采用多因素Logistic回歸分析；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1癌組織與癌周組織P120ctn、p53及CK5/6陽性表達(dá)率比較：癌組織P120ctn、p53及CK5/6陽性表達(dá)率均顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織與癌周組織P120ctn p53及CK5/6陽性表達(dá)率比較n(%)

2.2癌組織P120ctn、p53及CK5/6表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系：P120ctn陽性表達(dá)率與分子分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期無關(guān)(P>0.05)；p53與腫瘤直徑、分子分型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P<0.05)，與年齡、是否絕經(jīng)無關(guān)(P>0.05)；CK5/6與分子分型、組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，與年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 癌組織P120ctn p53及CK5/6表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系n(%)

2.3癌組織P120ctn、p53及CK5/6表達(dá)相關(guān)性：Spearman秩相關(guān)分析顯示，癌組織P120ctn與p53、CK5/6表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.384、0.406)，p53與CK5/6表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.581)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4術(shù)前NAC療效：120例患者術(shù)前經(jīng)2個(gè)周期NAC后，有27例(22.50%)達(dá)CR，49例(40.83%)達(dá)PR，34例(28.33%)SD，10例(8.33%)發(fā)生PD，有效率為63.33%(76/120)。

2.5影響患者NAC療效的單因素分析：?jiǎn)我蛩胤治鲲@示，腫瘤直徑>2cm、組織學(xué)分級(jí)G3、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、P120ctn陽性表達(dá)、p53陽性表達(dá)、CK5/6陽性表達(dá)者有效率較低(P<0.05)；但患者年齡、是否絕經(jīng)、分子分型、臨床分期與NAC療效無關(guān)(P>0.05)。見表3。

表3 影響患者NAC療效的單因素分析n(%)

2.6影響患者NAC療效的多因素Logistic回歸分析：多因素Logistic回歸分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、P120ctn表達(dá)陽性、p53表達(dá)陽性是影響患者NAC療效的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響患者NAC療效的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

P120ctn最早是作為Src激酶底物被發(fā)現(xiàn)，其可通過與鈣粘蛋白胞漿近膜端結(jié)合成鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物，從而增強(qiáng)鈣粘蛋白穩(wěn)定性，參與細(xì)胞黏附、侵襲、遷移等行為調(diào)節(jié)；胞質(zhì)中P120ctn能通過誘導(dǎo)Ras同源基因家族成員A蛋白活化，增加應(yīng)力纖維形成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移；P120ctn還能與轉(zhuǎn)錄因子Kaiso相互作用，參與wnt信號(hào)通路中某些基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[7]。已有文獻(xiàn)指出[8]，P120ctn對(duì)浸潤(rùn)性導(dǎo)管乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、定植有很強(qiáng)的促進(jìn)作用。本文結(jié)果顯示，IBC患者癌組織P120ctn陽性表達(dá)率明顯升高，且與患者分子分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)有關(guān)，提示P120ctn可參與IBC發(fā)生發(fā)展過程，與沈倩等[9]報(bào)道相似。

p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)和人惡性腫瘤關(guān)聯(lián)度最高的基因，其編碼的p53蛋白由393個(gè)氨基酸組成，可通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活參與細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞分化、誘導(dǎo)凋亡過程，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用；但p53基因在內(nèi)外因素刺激下突變頻繁，而突變p53蛋白失去正常野生型p53蛋白功能，反而有損傷正常細(xì)胞DNA、促進(jìn)細(xì)胞異常增殖作用。因突變p53蛋白半衰期延遲，可在組織大量積聚，經(jīng)免疫組化檢測(cè)的p53蛋白一般是突變的p53。既往有報(bào)道指出[10]，p53在結(jié)直腸腺癌癌組織中陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織。本研究發(fā)現(xiàn)，IBC患者癌組織p53陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且p53與腫瘤直徑、分子分型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)。袁明明等[11]研究認(rèn)為，p53在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中高表達(dá)占比較高，且與患者分子分型、組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，支持本研究結(jié)果。

細(xì)胞角蛋白是主要分布于上皮細(xì)胞胞質(zhì)的骨架蛋白，其與其他胞質(zhì)內(nèi)輔助蛋白形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)可源于核膜、橫跨胞質(zhì)至上皮細(xì)胞間，因此能維持上皮組織連續(xù)性、完整性，其中CK5/6是指分子量為58kDa、56kDa的細(xì)胞角蛋白，可于乳腺腺中間細(xì)胞、定向肝細(xì)胞、肌上皮中間細(xì)胞表達(dá)，CK5/6異常升高可能提示上皮細(xì)胞癌。本文研究顯示，IBC患者癌組織CK5/6陽性表達(dá)率升高，且與分子分型、組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，提示CK5/6可參與IBC發(fā)展。陶玉梅等[12]報(bào)道指出，CK5/6在IBC患者癌組織中陽性表達(dá)率較高，且以三陰性乳腺癌中表達(dá)最高，其表達(dá)陽性意味著惡性程度更高、侵襲性更強(qiáng)、預(yù)后更差，而且CK5/6還與表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)呈正相關(guān)，與本研究有相似之處。

NAC在乳腺癌治療中占重要地位，通過NAC不僅可獲得患者藥敏反應(yīng)信息，為后期治療提供參考，還能對(duì)乳腺癌降期，使患者手術(shù)治療或保乳手術(shù)治療成為可能，因此早期預(yù)測(cè)NAC療效對(duì)臨床診療方案制定十分重要。本文結(jié)果顯示，120例患者術(shù)前經(jīng)2個(gè)周期NAC后，有效率可達(dá)63.33%，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、P120ctn及p53表達(dá)陽性是影響患者NAC療效的危險(xiǎn)因素，提示P120ctn、p53或許可作為IBC患者NAC的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，這可能與P120ctn、p53能介導(dǎo)腫瘤耐藥性有關(guān)，值得深入研究。不過本研究并未發(fā)現(xiàn)CK5/6對(duì)患者NAC療效影響，可能因?yàn)镃K5/6并非是影響患者化療敏感性的因素，這一結(jié)果也可能受研究樣本選擇影響，后期可擴(kuò)大樣本、進(jìn)行多中心研究。上述結(jié)果提示臨床，通過P120ctn、p53靶向調(diào)控或可以抑制乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移，改善患者預(yù)后，這為后期乳腺癌治療靶點(diǎn)發(fā)掘提供了新思路。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，癌組織P120ctn、p53及CK5/6表達(dá)互呈正相關(guān)，提示P120ctn、p53、CK5/6在IBC發(fā)生、發(fā)展中可能存在一定協(xié)同作用。本研究不足之處在于，受隨訪時(shí)間限制，未分析P120ctn、p53及CK5/6表達(dá)與患者遠(yuǎn)期預(yù)后關(guān)系，后期完善隨訪后可進(jìn)一步探究。

綜上所述，IBC患者癌組織P120ctn、p53、CK5/6陽性表達(dá)率明顯升高，且均與患者臨床病理特征表現(xiàn)出一定相關(guān)性，其中P120ctn、p53陽性表達(dá)是影響患者NAC療效的危險(xiǎn)因素，可能作為IBC患者NAC療效的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)加以探究。