周華勇， 趙玉萍， 楊 旭， 張珊珊， 季一飛

(四川省南充市中心醫(yī)院/川北學(xué)院第二臨床學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科， 四川 南充 637000)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是指腦實(shí)質(zhì)非外傷性?xún)?nèi)血管破裂導(dǎo)致的出血，是腦卒中的一種類(lèi)型，具有較高的發(fā)病率、致殘致死率，嚴(yán)重影響生命健康。因此，研究ICH發(fā)病機(jī)制以及尋找防治新靶點(diǎn)在臨床上具有重要意義。研究表明[1]，ICH發(fā)生時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia,MG)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要免疫防線(xiàn)，首先做出反應(yīng)，其活化后參與調(diào)控腦損傷引起的炎性反應(yīng)，在神經(jīng)損傷反應(yīng)過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。臨床上右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)廣泛用于重癥病患的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛。大量研究證實(shí)，DEX具有抑制炎性反應(yīng)、抗氧化、抗凋亡等作用，對(duì)腦、心肌等多種組織器官缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[2]。近年來(lái)有研究表明[3]，DEX能夠通過(guò)抑制MG活化以及P2X7受體(Purinergic P2X7 receptor,P2X7R)激活發(fā)揮腦保護(hù)作用。但臨床上DEX對(duì)ICH造成的腦損傷的作用研究較少。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA)作為重要的基因調(diào)控分子，在機(jī)體炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[4]。研究顯示，miR-150-5p在膠原酶誘導(dǎo)的出血性中風(fēng)大鼠的血漿中表達(dá)上調(diào)[5]，但其在ICH大鼠中的作用還未有研究。本文通過(guò)構(gòu)建ICH大鼠模型，旨在探討DEX對(duì)ICH大鼠MG活化的影響以及miR-150-5p/P2X7R軸的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雄性SD大鼠65只，6周齡，體質(zhì)量200-220g(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號(hào)為SCXK(粵)2018-0034)。飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度(22-25)℃，濕度為50%～55%，晝夜交替為12h∶12h。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間自由采食飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照本院國(guó)家衛(wèi)生研究院和倫理委員會(huì)發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南》進(jìn)行，且符合動(dòng)物的3R原則。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑:DEX(四川省維克奇生物科技有限公司)；miR-150-5p antagomir及其陰性對(duì)照NC antagomir(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)；HE染色試劑盒、TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒、TRIzol試劑盒和DAB顯色試劑盒(均購(gòu)買(mǎi)于北京索萊寶)；SuperScript IV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司)；P2X7R抗體(美國(guó)EMD Millipore公司)；Iba-1抗體(Alexa Fluor?488熒光)、β-actin抗體、羊抗兔IgG(HRP標(biāo)記)(英國(guó)Abcam公司)；miR-negative control(NC)、miR-150-3p mimics(上海漢恒生物科技有限公司)；293T細(xì)胞(深圳市豪地華拓生物科技有限公司)。

1.3大鼠的分組及處理:將大鼠分為假手術(shù)(sham)組(n=12)與模型(model)組(n=63)。參照文獻(xiàn)[6]方法建立ICH大鼠模型：大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，在腦立體定位儀上固定大鼠頭部，對(duì)正中部位的頭皮進(jìn)行消毒、切口，然后分離骨膜，暴露冠狀縫、前囪。在前囪前2.0mm、中線(xiàn)右側(cè)3.0mm的地方鉆一個(gè)1.0mm直徑的圓孔，使用微量注射器經(jīng)股動(dòng)脈抽取血液50μL，并將其緩慢注射至圓孔內(nèi)(速度2μL/min)，微量注射器在原地停留10min，以防止回流，最后將傷口縫合，并進(jìn)行消毒以防感染。通過(guò)觀察主要出血部位是海馬CA2區(qū)，出血量約25%。提尾時(shí)自行向右側(cè)轉(zhuǎn)圈或內(nèi)收為造模成功標(biāo)準(zhǔn)[7]。造模成功的大鼠隨機(jī)分為DEX低劑量(DEX-L)組、DEX高劑量(DEX-H)組、DEX+NC antagomir組和DEX+miR-150-5p antagomir組，每組12只。DEX低劑量組腹腔注射DEX 25μg/kg，DEX高劑量組腹腔注射DEX 50μg/kg，DEX+NC antagomir組腹腔注射DEX 50μg/kg和NC antagomir(20nmoL/L)5μL，DEX+miR-150-5p antagomir組腹腔注射DEX 50μg/kg和miR-150-5p antagomir(20nmoL/L)5μL，假手術(shù)組腹腔注射等量生理鹽水，每日1次，每次0.2mL，連續(xù)給藥7 d。

1.4神經(jīng)功能評(píng)分:末次給藥結(jié)束后24h，根據(jù)改良后的Garcia行為學(xué)評(píng)分法[8]從自主運(yùn)動(dòng)(0～3分)、體態(tài)對(duì)稱(chēng)性(1～3分)、前肢伸展運(yùn)動(dòng)(0～3分)、兩側(cè)胡須觸摸反應(yīng)(1～3分)、抓持和攀爬鐵籠能力(1～3分)和兩側(cè)身體觸覺(jué)反射(1～3分)6個(gè)方面對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，得分總和作為最終神經(jīng)功能評(píng)分，分?jǐn)?shù)越低提示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重，功能正常時(shí)得分最高為18分，功能損傷最嚴(yán)重時(shí)得分最低為3分。

1.5ELISA檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β含量:神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)束后，經(jīng)頸靜脈取血0.5mL，離心分離血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算TNF-α、IL-1β含量。

1.6腦組織含水量的測(cè)定:取血完成后，每組隨機(jī)挑選4只大鼠，稱(chēng)重后麻醉，斷頸處死大鼠取腦組織，濾紙吸取腦組織表面液體稱(chēng)取濕重，置于100℃烘箱中24h后稱(chēng)取干重。根據(jù)干濕重法計(jì)算腦組織含水量：含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.7HE染色觀察腦組織病理變化:各組隨機(jī)選取4只大鼠，取出血區(qū)腦組織，固定后制備常規(guī)石蠟切片，HE染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察大腦皮層病理變化。

1.8免疫熒光觀察MG細(xì)胞形態(tài):取1.7制備好的石蠟切片，進(jìn)行脫蠟處理，運(yùn)用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)漂洗，修復(fù)后，加入2%牛血清白蛋白(BSA)封閉1h，漂洗后加入兔抗鼠Iba-1一抗(1∶500)，4℃孵育過(guò)夜，再次漂洗后加入二抗(1∶1000)，室溫孵育1h，PBS漂洗，光學(xué)顯微鏡下觀察MG細(xì)胞形態(tài)。顯微鏡下拍照后采用ImageJ軟件對(duì)陽(yáng)性染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.9qRT-PCR法檢測(cè)腦組織miR-150-5p、P2X7R mRNA相對(duì)表達(dá):取剩余大鼠，處死后分離出血區(qū)腦組織，部分組織加入TRIzol試劑提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以U6、β-actin為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)miR-150-5p、P2X7 mRNA相對(duì)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.10Western blot法檢測(cè)腦組織Iba-1、P2X7R蛋白表達(dá):加入蛋白裂解液提取1.9剩余大鼠出血區(qū)腦組織總蛋白，采用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度。取30μg蛋白上樣進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，TBST清洗后加入4%脫脂牛奶封閉2h，加入Iba-1(1∶500)、P2X7R(1∶1000)、β-actin(1∶1000)一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶2500)。室溫下孵育2h，TBST清洗后利用DAB顯色試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析條帶灰度值。目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參(β-actin)條帶灰度值。

1.11雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-150-5p的下游靶基因可能為P2X7R。PCR擴(kuò)增P2X7R mRNA與miR-150-5p潛在的野生結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建P2X7R野生型(P2X7R-WT)和突變型(P2X7R-MUT)重組質(zhì)粒載體，將miR-NC、miR-150-5p mimics與P2X7R-WT、P2X7R-MUT共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，收集并裂解細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因分析。

2 結(jié) 果

2.1DEX對(duì)ICH大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響：給藥7d后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，DEX低、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均明顯升高(P<0.05)；與DEX高劑量組、DEX+NC antagomir組比較，DEX+miR-150-5p antagomir組神經(jīng)功能評(píng)分顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的比較

2.2DEX對(duì)ICH大鼠血清中炎性因子含量以及腦組織含水量的影響：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量以及腦組織含水量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，DEX各劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量及腦組織含水量明顯降低(P<0.05)；與DEX高劑量組、DEX+NC antagomir組比較，DEX+miR-150-5p antagomir組上述指標(biāo)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3、表4。

表3 各組大鼠血清中TNF-α IL-1β含量的比較

表4 各組大鼠腦組織含水量的比較

2.3DEX對(duì)ICH大鼠腦組織病理學(xué)變化的影響：假手術(shù)組大鼠腦組織中未見(jiàn)出血灶，大腦皮質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，排列規(guī)律，結(jié)構(gòu)整齊；模型組大鼠腦組織中大量紅細(xì)胞與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列凌亂，出現(xiàn)溶解壞死和核固縮現(xiàn)象；DEX各劑量組病理變化逐漸減輕，紅細(xì)胞與炎性細(xì)胞數(shù)量減少，核固縮現(xiàn)象減少；DEX+NC antagomir組的病理變化與DEX-H組的基本一致；DEX+miR-150-5p antagomir組可見(jiàn)大量紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大腦皮質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞排列無(wú)序。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理變化(HE,×400)

2.4DEX對(duì)ICH大鼠MG細(xì)胞形態(tài)變化的影響：假手術(shù)組MG數(shù)量較少，且胞體小，分支與突起細(xì)長(zhǎng)，未見(jiàn)活化；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中MG數(shù)量明顯增加，胞體變大，細(xì)胞突起與分支縮短變粗，MG活化；與模型組比較，DEX各劑量組MG數(shù)量明顯減少，胞體變??；與DEX高劑量組、DEX+NC antagomir組比較，DEX+miR-150-5p antagomir組MG數(shù)量顯著增多，胞體變大。見(jiàn)圖2。定量分析結(jié)果顯示，6組MG數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=126.561，P=0.000)；模型組MG數(shù)量[(139.46±12.38)個(gè)/視野]明顯多于假手術(shù)組[(3.59±0.41)個(gè)/視野](P<0.05)，DEX低、高劑量組MG數(shù)量[(98.67±11.42)個(gè)/視野、(43.79±6.21)個(gè)/視野]明顯少于模型組(P<0.05)，DEX+miR-150-5p antagomir組MG數(shù)量[(119.72±12.48)個(gè)/視野]明顯多于DEX高劑量組、DEX+NC antagomir組[(45.86±6.25)個(gè)/視野](P<0.05)。

圖2 各組大鼠腦組織中MG形態(tài)的變化(免疫熒光,×400)

2.5DEX對(duì)ICH大鼠腦組織中miR-150-5p、P2X7R mRNA表達(dá)的影響：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中miR-150-5p表達(dá)顯著降低(P<0.05)，P2X7R mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，DEX各劑量組大鼠腦組織中miR-150-5p表達(dá)顯著升高(P<0.05)，P2X7R mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與DEX高劑量組、DEX+NC antagomir組比較，DEX+miR-150-5p antagomir組腦組織中miR-150-5p表達(dá)顯著降低(P<0.05)，P2X7R mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠腦組織中miR-150-5p P2X7R mRNA表達(dá)的比較

2.6DEX對(duì)ICH大鼠腦組織中Iba-1、P2X7R蛋白表達(dá)的影響：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中Iba-1、P2X7R蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，DEX各劑量組Iba-1、P2X7R蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與DEX高劑量組、DEX+NC antagomir組比較，DEX+miR-150-5p antagomir組腦組織中Iba-1、P2X7R蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表6。

表6 各組大鼠腦組織中Iba-1 P2X7R蛋白表達(dá)的比較

圖3 各組大鼠腦組織中Iba-1、P2X7R蛋白表達(dá)A：sham；B：model；C：DEX-L；E：DEX-H；E：DEX+NC antagomir；F：DEX+miR-150-5p antagomir

2.7P2X7R是miR-150-5p的下游靶基因：通過(guò)Target Scan軟件對(duì)miR-150-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，P2X7R 3’端存在miR-150-5p的互補(bǔ)序列，見(jiàn)圖4。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對(duì)miR-150-5p的靶基因驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miR-150-5p mimics能夠顯著增加P2X7R-WT的熒光素酶活性(P<0.05)，而對(duì)P2X7R-MUT的熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)。見(jiàn)表7。

圖4 miR-150-5p靶向調(diào)控P2X7R表達(dá)

表7 熒光素酶活性的比較

3 討 論

ICH發(fā)病率高、致死率高，嚴(yán)重影響病患健康，但目前對(duì)于ICH尚無(wú)有效的防治手段。炎性反應(yīng)是ICH后導(dǎo)致腦損傷的主要病理機(jī)制，MG是神經(jīng)系統(tǒng)中主要的免疫細(xì)胞，其活化后促進(jìn)組織TNF-α、IL-1β等炎性因子的分泌[9]。本研究結(jié)果表明ICH模型大鼠神經(jīng)功能評(píng)分下降，腦組織中大量紅細(xì)胞與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列凌亂，出現(xiàn)溶解壞死和核固縮現(xiàn)象，提示大鼠神經(jīng)功能受損。免疫熒光法檢測(cè)MG形態(tài)變化，結(jié)果顯示ICH模型大鼠MG數(shù)量增加，胞體變大，細(xì)胞突起與分支縮短變粗；Iba-1是MG的一種主要標(biāo)記抗體，ICH模型大鼠腦組織中Iba-1蛋白表達(dá)明顯升高，提示ICH后MG活化。此外，ICH模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量升高，進(jìn)一步說(shuō)明ICH造成的腦損傷與起機(jī)體炎性反應(yīng)的發(fā)生相關(guān)。以上結(jié)果均提示ICH造模成功。

DEX已被證實(shí)具有減少炎性因子釋放，改善機(jī)體免疫、抑制氧化應(yīng)激的作用[3]。已有研究顯示，DEX能夠改善ICH大鼠的神經(jīng)功能損傷和氧化應(yīng)激損傷并抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[10]。但DEX對(duì)MG活化的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果表明，DEX干預(yù)后的ICH大鼠神經(jīng)功能評(píng)分增加，血清中TNF-α、IL-1β含量下降，與上述研究相同，說(shuō)明DEX能夠恢復(fù)ICH大鼠的神經(jīng)功能，并減輕大鼠體內(nèi)炎癥的發(fā)生。此外，我們還觀察到DEX干預(yù)使ICH大鼠腦組織病變減輕，MG數(shù)量減少，逐漸恢復(fù)靜息狀態(tài)，腦組織中Iba-1蛋白表達(dá)下降，提示DEX對(duì)ICH后MG活化具有抑制作用，且通過(guò)抑制MG活化減輕ICH大鼠炎癥的發(fā)生。

研究表明，P2X7R是主要在免疫細(xì)胞以及上皮細(xì)胞中表達(dá)的嘌呤受體離子通道，且DEX的作用機(jī)制與調(diào)控P2X7R通路有關(guān)[3]。另有研究表明，P2X7R能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，促進(jìn)MG活化，誘導(dǎo)炎性因子的釋放，參與多種神經(jīng)疼痛調(diào)節(jié)過(guò)程[11]。一些MicroRNA被證實(shí)在ICH炎性反應(yīng)以及ICH引起的細(xì)胞凋亡等發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[12]。既往研究顯示，骨關(guān)節(jié)炎患者外周血中miR-150與P2X7R mRNA水平呈負(fù)相關(guān)[13]，且本研究通過(guò)軟件預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，P2X7R確實(shí)是miR-150-5p的作用靶點(diǎn)。近期研究表明，miR-150-5p在老年急性缺血性腦卒中患者血清中下調(diào)表達(dá)，可作為診斷老年急性缺血性腦卒中的生物學(xué)標(biāo)志物[14]。與此研究結(jié)果相似的是，本研究發(fā)現(xiàn)ICH模型大鼠腦組織中miR-150-5p表達(dá)降低，P2X7R mRNA和蛋白表達(dá)升高，二者趨勢(shì)正好相反，提示miR-150-5p、P2X7R參與ICH發(fā)生發(fā)展，可能在ICH大鼠中發(fā)揮靶向調(diào)控作用。深入研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，DEX各劑量組大鼠腦組織中miR-150-5p表達(dá)升高，P2X7R mRNA和蛋白表達(dá)降低，提示DEX能夠上調(diào)ICH大鼠腦組織中miR-150-5p的表達(dá)，下調(diào)P2X7R表達(dá)，進(jìn)而影響阻礙MG活化。DEX干預(yù)基礎(chǔ)上加入miR-150-5p antagomir后大鼠血清中炎性因子含量和Iba-1蛋白表達(dá)升高，組織結(jié)構(gòu)病變加重，P2X7R表達(dá)升高，再次證實(shí)DEX能夠通過(guò)調(diào)控miR-150-5p/P2X7R軸抑制MG活化，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在ICH中發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，DEX可抑制MG活化，在ICH中發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能與上調(diào)miR-150-5p、下調(diào)P2X7R表達(dá)有關(guān)。