李秋霞， 王廣謀， 陳 健， 王 華， 段國平

(1.湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科, 湖南 長沙 410000 2.湖南省雙峰縣走馬街眼科診療中心眼科, 湖南 婁底 417700)

白內(nèi)障(Cataract)是世界上常見的能夠?qū)е率鞯难鄄考膊?，其發(fā)生與年齡有關(guān)，而糖尿病也是引發(fā)白內(nèi)障的原因之一，且該病患者發(fā)生白內(nèi)障的時間更早，頻率也更高[1]。目前治療白內(nèi)障的方法是通過手術(shù)摘除晶狀體后用人工晶狀體替換，但這種手術(shù)會產(chǎn)生角膜水腫和高眼壓等副作用[2]。因此，尋找治療白內(nèi)障有效的方案及藥物是當(dāng)前的重要任務(wù)。據(jù)研究可知，Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associating protein 1，Keap1)-核因子紅細胞2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)通路是抗氧化應(yīng)激的重要通路，且在炎癥性疾病、糖尿病以及與年齡相關(guān)的眼病等疾病的恢復(fù)中發(fā)揮重要作用[3]。橙皮素是一種天然的生物類黃酮，具有明顯的抗炎、抗氧化、抗凋亡等功效，能夠保護心血管、葡萄糖代謝和神經(jīng)系統(tǒng)[4]。研究已經(jīng)證明橙皮素可以減輕糖尿病引起的大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥和細胞凋亡，還可以抑制亞硒酸鹽誘導(dǎo)的白內(nèi)障形成[5,6]，但其治療白內(nèi)障的作用機制仍不清楚。因此，本實驗通過建立D-半乳糖白內(nèi)障大鼠模型，探討橙皮素對其氧化應(yīng)激損傷的影響以及對Keap1/Nrf2/ARE信號通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1動物:SPF級Wistar雄性大鼠72只，8周齡體重180～210g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2021-0011。所有大鼠均在溫度24～26℃，濕度60%的環(huán)境中飼養(yǎng)。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2藥品及試劑:橙皮素，純度：HPLC≥98%，購自于四川省維克奇生物科技有限公司；復(fù)明膠囊，購自于陜西君壽堂制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20060308；D-半乳糖，純度：HPLC≥99%，購自于浙江一新制藥股份有限公司；復(fù)方托吡卡胺滴眼液，購自于沈陽興齊眼藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20123453；Nrf2抑制劑ATRA購自于美國MedChemExpress(MCE)；蘇木素和伊紅染液均購自于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)購自于碧云天生物有限公司；BSA檢測試劑盒均購自于上海江萊生物科技有限公司；SOD、CAT、GSH-Px ELISA試劑盒均購自于武漢賽培生物科技有限公司；Keap1、Nrf2、HO-1一抗購自于英國Abcam生物公司；山羊抗大鼠IgG二抗購自于亞科因(武漢)生物技術(shù)有限公司；裂隙燈顯微鏡購自于上海涵飛醫(yī)療器械有限公司；熒光顯微鏡購自于olympus；凝膠成像儀購自于美國伯樂BIO-RAD。

1.3D-半乳糖誘導(dǎo)的白內(nèi)障大鼠模型制備:參照文獻[7]制備D-半乳糖誘導(dǎo)的白內(nèi)障大鼠模型。全部大鼠先正常飼喂一周，然后挑取部分大鼠每天皮下注射200mg/kg的D-半乳糖，持續(xù)8周。假手術(shù)組每天注射等量的無菌水，其它飼喂條件相同。4周后，在裂隙燈下觀察大鼠的晶狀體，出現(xiàn)渾濁即為造模成功。

1.4動物分組和給藥:將所有大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組、橙皮素低、高劑量組、橙皮素高劑量+Nrf2抑制劑ATRA組，每組12只。在造模第5周時，陽性對照組大鼠灌胃30mg/kg的復(fù)明膠囊，橙皮素低、高劑量組分別以50mg/kg、150mg/kg灌胃給藥，橙皮素高劑量+ATRA組先灌胃100mg/kg橙皮素，再腹腔注射10mg/kg的ATRA[8]。假手術(shù)組和模型組均注射等量的生理鹽水。每天1次，持續(xù)給藥4周。

1.5觀察大鼠晶狀體組織渾濁程度:在實驗結(jié)束后，用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳后，在裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠的所有晶狀體的渾濁程度：0級：晶狀體無異常；1級：晶狀體周圍出現(xiàn)空泡；2級：空泡消失，晶狀體皮層出現(xiàn)朦朧；3級：晶狀體皮層完全渾濁，但核透明；4級：晶狀體核也出現(xiàn)渾濁，逐漸與皮層混為一體。等級越高說明渾濁程度越高。

1.6HE染色觀察大鼠晶狀體上皮組織病理學(xué)變化:將所有大鼠麻醉后處死，隨機選取6只大鼠的左眼晶狀體置于4%多聚甲醛中固定過夜后制備石蠟切片；右眼晶狀體用于ELISA檢測；其余6只大鼠的晶狀體，保存在-80℃?zhèn)溆?。將晶狀體切片用二甲苯和不同濃度梯度的乙醇溶液脫蠟；PBS清洗，然后蘇木素染液染色10min，置于1%鹽酸中分化5s，PBS沖洗后用伊紅染液復(fù)染5min，染色結(jié)束后用乙醇溶液脫水，二甲苯透明，最后晾干并用中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察晶狀體上皮組織的病理形態(tài)。

1.7TUNEL法檢測晶體上皮組織細胞凋亡率:將1.6中的石蠟切片分別用二甲苯和乙醇充分脫蠟和水化，然后將切片放入先前配制好的TUNEL反應(yīng)混合液中，37℃孵育60min。PBS沖洗后，用DAPI進行細胞核染色，最后用抗熒光淬滅封片劑封片。置于熒光顯微鏡下觀察并拍照計算凋亡率。

1.8ELISA檢測晶狀體中氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、CAT、GSH-Px的活性:將1.6中6只大鼠的右眼晶狀體分別放入研磨器加入適量生理鹽水搗碎，1000×g離心10min，取上清液。然后按照ELISA試劑盒的操作步驟分別檢測晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px的表達水平。

1.9Western blotting檢測大鼠晶狀體組織中通路蛋白Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達水平:取6只大鼠的左眼晶狀體分別置于勻漿器中，分別加入細胞質(zhì)和細胞核蛋白提取液進行勻漿，并制備蛋白樣品。bcA試劑盒檢測蛋白濃度后，上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，冰浴轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放入封閉液中室溫孵育2h，加入一抗稀釋液(Keap1、Nrf2抗體稀釋倍數(shù)1∶1000，HO-1抗體稀釋倍數(shù)1∶2000)，室溫孵育2h，洗膜后用羊抗鼠二抗稀釋液室溫孵育2h，最后加入發(fā)光試劑顯色，凝膠成像儀拍照并分析蛋白含量，細胞核Nrf2以H3為內(nèi)參蛋白，其它蛋白以β-actin為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié) 果

2.1橙皮素對白內(nèi)障大鼠晶狀體組織渾濁程度的影響:與假手術(shù)組相比，模型組中大鼠晶狀體渾濁程度顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、橙皮素低、高劑量組大鼠晶狀體渾濁程度顯著降低(P<0.05)；與橙皮素高劑量組相比，橙皮素高劑量+ATRA組大鼠晶狀體渾濁程度顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各實驗組大鼠晶狀體組織渾濁程度

2.2橙皮素對白內(nèi)障大鼠晶狀體上皮組織病理學(xué)變化的影響:HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠晶狀體上皮組織細胞排列整齊，形態(tài)正常；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠晶狀體上皮組織細胞數(shù)量減少，排列紊亂，出現(xiàn)水腫且細胞間隙增大；與模型組相比，陽性對照組和橙皮素低、高劑量組上皮細胞逐漸增多，水腫情況減輕，排列有序且緊密；橙皮素高劑量+ATRA組與模型組形態(tài)相似。見圖1。

圖1 橙皮素對白內(nèi)障大鼠晶狀體上皮組織形態(tài)的影響(HE染色，×400)

2.3橙皮素對白內(nèi)障大鼠晶狀體上皮細胞凋亡率的影響:與假手術(shù)組相比，模型組中大鼠晶狀體上皮細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、橙皮素低、高劑量組大鼠晶狀體上皮細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與橙皮素高劑量組相比，橙皮素高劑量+ATRA組大鼠晶狀體上皮細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。見下圖2、表2。

圖2 TUNEL檢測各組大鼠晶狀體上皮細胞情況(綠色熒光，×400)

表2 TUNEL檢測各組大鼠晶狀體上皮細胞的凋亡率

2.4橙皮素對白內(nèi)障大鼠晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px活性的影響:與假手術(shù)組相比，模型組中大鼠晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、橙皮素低、高劑量組大鼠晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)；與橙皮素高劑量組相比，橙皮素高劑量+ATRA組大鼠晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各實驗組大鼠晶狀體中SOD CAT GSH-Px活性的影響

2.5橙皮素對白內(nèi)障大鼠晶狀體中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的影響:與假手術(shù)組相比，模型組中大鼠晶狀體中Keap1和細胞質(zhì)Nrf2蛋白表達升高，細胞核Nrf2和HO-1蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、橙皮素低、高劑量組大鼠晶狀體中Keap1和細胞質(zhì)Nrf2蛋白表達降低，細胞核Nrf2和HO-1蛋白表達升高(P<0.05)；與橙皮素高劑量組相比，橙皮素高劑量+ATRA組大鼠晶狀體中Keap1和細胞質(zhì)Nrf2蛋白表達升高，細胞核Nrf2和HO-1蛋白表達降低(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 橙皮素對白內(nèi)障大鼠晶狀體中Keap1 Nrf2 HO-1蛋白的影響

圖3 不同實驗組白內(nèi)障大鼠晶狀體中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的表達

3 討 論

白內(nèi)障是引發(fā)失明的主要原因，與晶狀體的氧化損傷有關(guān)，其主要特征表現(xiàn)為晶狀體渾濁、視力障礙和光散射。雖然白內(nèi)障多發(fā)生于老年人，但是幼兒也可能因遺傳疾病而在出生時便患有白內(nèi)障[9]。因此，深入研究白內(nèi)障的發(fā)病機制對其預(yù)防和治療有重要作用。本研究建立白內(nèi)障大鼠模型發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠晶狀體渾濁程度較高，晶狀體上皮組織細胞排列不均勻，數(shù)量減少且水腫，細胞凋亡率也升高。揭示了白內(nèi)障大鼠模型建立成功。橙皮素是從天然植物中提取的一種化合物，其具有抗炎癥、抗氧化、降血糖、抗腫瘤以及保護神經(jīng)系統(tǒng)等廣泛的藥理作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性對照組和橙皮素低、高劑量組分別給藥后，大鼠晶狀體渾濁程度降低，晶狀體上皮組織細胞數(shù)量增多，水腫程度減輕，細胞凋亡率也降低。表明了橙皮素能夠降低白內(nèi)障大鼠晶狀體的渾濁程度和細胞凋亡率，減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的晶狀體病理性損傷。

Keap1是細胞中調(diào)節(jié)Nrf2水平的主要因子之一，與Nrf2相互作用并維持Nrf2的穩(wěn)定。當(dāng)受到氧化條件刺激后，ROS的不斷產(chǎn)生使Keap1的半胱氨酸殘基失去泛素活性，導(dǎo)致Nrf2從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核中，并在細胞核中與ARE結(jié)合啟動下游HO-1等抗氧化基因的表達[10,11]。Keap1/Nrf2/ARE通路是抗氧化應(yīng)激最重要的通路之一，參與心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等疾病的治療。研究證明，抑制Keap1激活Nrf2通路，能夠減輕糖尿病性白內(nèi)障大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]?？寡趸衔顲AT和GSH-Px能夠通過將過氧化物分解為H2O和O2來保護機體免受損傷，SOD是生命體的一種反應(yīng)酶，可促進超氧化物歧化為O2和H2O2，并與CAT相互配合使機體保持氧化還原平衡[6,13]。本研究結(jié)果顯示，模型組中大鼠晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px活性、細胞核Nrf2、HO-1蛋白表達均降低，Keap1和細胞質(zhì)Nrf2蛋白表達升高；在陽性對照組、橙皮素組給藥后大鼠晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px活性、細胞核Nrf2、HO-1蛋白表達均升高，Keap1和細胞質(zhì)Nrf2蛋白表達降低，揭示了橙皮素能夠通過抑制Keap1，促進細胞質(zhì)Nrf2轉(zhuǎn)移至細胞核與ARE相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HO-1結(jié)合，提高抗氧化因子的活性。而加入Nrf2抑制劑ATRA后發(fā)現(xiàn)，大鼠晶狀體中的上述抗氧化因子的活性降低，通路相關(guān)蛋白表達趨勢也與橙皮素高劑量組相反。進一步揭示了橙皮素減輕白內(nèi)障大鼠的氧化應(yīng)激損傷的作用可能是通過調(diào)控Keap1/Nrf2/ARE信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，橙皮素可減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的白內(nèi)障大鼠氧化應(yīng)激損傷，其作用機制可能與下調(diào)Keap1的表達，使Nrf2轉(zhuǎn)移至細胞核，促進HO-1等抗氧化基因表達有關(guān)。因此，橙皮素在白內(nèi)障的治療中可能具有潛在作用。但是橙皮素對Keap1-Nrf2通路下游因子的作用機制還有待進一步深入研究。