施 文， 周志強(qiáng)， 蔡 明， 邱 建， 陳錦鵬， 何向鋒， 孫永強(qiáng)

(南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院/南通市第一人民醫(yī)院胃腸甲乳外科， 江蘇 南通 226000)

結(jié)直腸癌(CRC)是最常見的胃腸道腫瘤之一，近些年發(fā)病率不斷上升。自20世紀(jì)90年代初以來，結(jié)直腸癌在年輕人中的發(fā)病率幾乎翻了一番[1]。CRC篩查方案的實(shí)施提高了早期檢出率，但許多CRC患者仍處于晚期，往往失去了治療性切除的機(jī)會。因此，迫切需要研究新的生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)來改善結(jié)直腸癌的預(yù)后。長非編碼RNA(lncRNA)是一種長度超過200個核苷酸、缺乏能夠產(chǎn)生功能蛋白的開放閱讀框的非編碼轉(zhuǎn)錄本[2]。大量研究表明，lncRNA廣泛存在于人類細(xì)胞中，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生等各種生物事件中發(fā)揮著重要作用[3]。lncRNA被發(fā)現(xiàn)是相互競爭的內(nèi)源性RNA，它們吞噬miRNA并調(diào)節(jié)miRNA的靶標(biāo)。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在包括CRC在內(nèi)的各種癌癥類型中存在失調(diào)，并且在所有癌癥特征中都發(fā)揮著不可或缺的作用[4]。KCNQ1反鏈/反義轉(zhuǎn)錄本1 (Opposite Strand/Antisense Transcript 1，KCNQ1OT1)基因位于11p15.5，是lncRNA組的成員。KCNQ1OT1與染色質(zhì)相互作用，通過表觀遺傳修飾調(diào)控多個靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前，關(guān)于其在腫瘤中的異常表達(dá)和功能的研究報道較少。Feng等發(fā)現(xiàn)LncRNA KCNQ1OT1調(diào)控microRNA-9-LMX1A表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞進(jìn)展[5]。Qiao等指出LncRNA KCNQ1OT1通過miR-124-3p/TRIM14軸參與舌癌順鉑耐藥[6]。Li等發(fā)現(xiàn)LncRNA KCNQ1OT1通過靶向MiR-218-5p/HS3ST3B1促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展[7]。然而，KCNQ1OT1在CRC中的潛在分子機(jī)制尚未得到充分的研究。本研究旨在探討LncRNA KCNQ1OT1在結(jié)直腸癌中的作用及其可能的機(jī)制研究，希望為結(jié)直腸癌患者的治療找到新的理論靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1臨床標(biāo)本：收集經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)的CRC標(biāo)本和術(shù)后患者匹配的正常組織，該研究得到了南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)以及患者書面知情同意。所有組織標(biāo)本立即用液氮冷凍，置于-80℃保存至使用。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)：人CRC細(xì)胞系SW480和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系CCC-HIE-2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。SW480在L15培養(yǎng)基(美國Invitrogen)中培養(yǎng)，CCC-HIE-2在Dulbecco’s modified Eagle’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素(美國HyClone)。所有細(xì)胞系在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2質(zhì)粒來源及細(xì)胞轉(zhuǎn)染：KCNQ1OT1和PAK4的干擾以及過表達(dá)質(zhì)粒購自北京擎科生物有限公司，miR-145模擬物和抑制劑從GenePharma獲得，根據(jù)制造商的說明，用Lipofectamine 3000(中國賽默飛世爾科技)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，用于后續(xù)實(shí)驗。

1.2.3雙熒光素酶報告基因檢測：pmirGLO質(zhì)粒購自優(yōu)寶生物(中國湖南長沙)。將KCNQ1OT1和PAK4的擴(kuò)增序列克隆到pmirGLO質(zhì)粒中。將相應(yīng)擴(kuò)增的突變序列插入質(zhì)粒中，與限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)ScaI和XbaI一起構(gòu)建突變載體。將構(gòu)建的KCNQ1OT1和PAK4野生型載體與miR-145模擬物一起轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，對照組細(xì)胞與模擬物對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，另外一組細(xì)胞共轉(zhuǎn)染KCNQ1OT1和PAK4突變型載體與miR-145模擬物，最后檢測并分析雙熒光素酶活性。

1.2.4RNA分離及qRT-PCR檢測：用Trizol試劑(Sigma-Aldrich)從組織或細(xì)胞系中分離總RNA。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)，隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)DNA(cDNA)。然后配置qRT-PCR反應(yīng)體系，循環(huán)程序為98℃ 2min，98℃ 10s、60℃ 15s和65℃ 15s，40個循環(huán)。用公式2-△△Ct分析各目的基因的相對表達(dá)量。GAPDH為KCNQ1OT1和PAK4的內(nèi)源性控制基因，U6為miR-145的內(nèi)源性控制基因。引物信息見表1。

表1 引物序列

1.2.5MTT實(shí)驗：離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，以1×106/mL重懸，100μL細(xì)胞懸液置于微滴板中。培養(yǎng)48h后，每孔加10μL MTT試劑，再孵育3h。每孔加入100μL洗滌試劑，避光孵育2h。最后，在450nm微滴定板上觀察每個孔的光吸收度。所有試劑均購自Biomart(中國北京)。

1.2.6細(xì)胞克隆形成實(shí)驗：用4mL 0.25%胰蛋白酶消化培養(yǎng)的細(xì)胞，接種在6孔板中，培養(yǎng)7d。當(dāng)細(xì)胞形成可見菌落時，取出培養(yǎng)基，在平板上加入固定液2～3mL。5min后棄固定液，加入0.5%結(jié)晶紫(上海Sigma-Aldrich)溶液與細(xì)胞孵育2h，在顯微鏡下觀察菌落。

1.2.7流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率：將細(xì)胞接種于24孔板中，孵育48h。收集上清液和貼壁細(xì)胞，使用FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒(BD Biosciences)，用異硫氰酸熒光素-膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶進(jìn)行雙重染色。將500μL細(xì)胞懸液與2μL Annexin(1mg/mL)和2μL碘化丙啶(1mg/mL)(CA1020，Solarbio，北京)孵育后，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率，將細(xì)胞區(qū)分為活細(xì)胞、死細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，并比較各實(shí)驗中凋亡細(xì)胞與對照轉(zhuǎn)染細(xì)胞的相對比例。

1.2.8Western Blot檢測蛋白表達(dá)：收集細(xì)胞，從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取蛋白，細(xì)胞蛋白裂解液用10% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，與特異性抗體孵育。以GAPDH抗體作為對照，anti-GAPDH和E-cadherin、N-cadherin購自Cell Signaling Technology。用超信號化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行蛋白檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理：采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以上實(shí)驗至少進(jìn)行了三次。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組獨(dú)立樣本比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA KCNQ1OT1、miR-145和PAK4在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)：結(jié)直腸癌組織中KCNQ1OT1、PAK4表達(dá)量高于癌旁組織(P<0.01)，miR-145表達(dá)量低于癌旁組織(P<0.01)；SW480細(xì)胞中KCNQ1OT1、PAK4表達(dá)量高于CCC-HIE-2細(xì)胞(P<0.01)，miR-145表達(dá)量低于CCC-HIE-2細(xì)胞(P<0.01)，見圖1和表2。

圖1 qRT-PCR技術(shù)檢測結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中LncRNA KCNQ1OT1、miR-145和PAK4的表達(dá)量

表2 不同組織和細(xì)胞中LncRNA KCNQ1OT1 miR-145和PAK4的差異表達(dá)量

2.2LncRNA KCNQ1OT1與miR-145以及miR-145與PAK4之間的關(guān)系：KCNQ1OT1和miR-145、miR-145與PAK4之間的結(jié)合位點(diǎn)見圖2。KCNQ1OT1 WT+miR-145 mimics組熒光素酶活性低于KCNQ1OT1 WT+mimics NC組(P<0.01)，PAK4 WT+miR-145 mimics組熒光素酶活性低于PAK4 WT+mimics NC組(P<0.01)，KCNQ1OT1與PAK4突變后熒光素酶活性與對照組比無明顯差異(P>0.05)，見表3。

表3 熒光素酶活性分析

圖2 lncRNA KCNQ1OT1與miR-145、miR-145與PAK4之間的關(guān)系

2.3敲低KCNQ1OT1或PAK4表達(dá)對SW480細(xì)胞的增殖、凋亡及EMT的影響：與siRNA NC組相比，KCNQ1OT1 siRNA組和PAK4 siRNA組細(xì)胞增殖活力顯著下調(diào)(P<0.05)；與siRNA NC組相比，KCNQ1OT1 siRNA組和PAK4 siRNA組SW480細(xì)胞克隆數(shù)目顯著減少(P<0.01)；KCNQ1OT1 siRNA組和PAK4 siRNA組N-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與siRNA NC組相比，KCNQ1OT1 siRNA組和PAK4 siRNA組細(xì)胞凋亡率顯著上調(diào)(P<0.01)，見圖3和表4。

表4 敲低KCNQ1OT1或PAK4表達(dá)后分析SW480細(xì)胞的增殖凋亡及

圖3 敲低KCNQ1OT1或PAK4表達(dá)對SW480細(xì)胞的增殖、凋亡及EMT的影響A：敲低KCNQ1OT1或PAK4表達(dá)后MTT分析SW480細(xì)胞活力；B：敲低KCNQ1OT1或PAK4表達(dá)后細(xì)胞克隆形成實(shí)驗檢測 SW480細(xì)胞克隆數(shù)目；C：敲低KCNQ1OT1或PAK4表達(dá)后Western blot檢測細(xì)胞EMT；D：敲低KCNQ1OT1或PAK4表達(dá)后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況

2.4敲低miR-145表達(dá)對SW480細(xì)胞的增殖、凋亡及EMT的影響：與inhibitor NC組相比，miR-145 inhibitor組細(xì)胞增殖活力顯著上調(diào)(P<0.05)，SW480細(xì)胞克隆數(shù)目顯著增加(P<0.01)，E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖4和表5。

表5 敲低miR-145表達(dá)后分析SW480細(xì)胞的增殖凋亡及EMT

圖4 敲低miR-145表達(dá)對SW480細(xì)胞的增殖、凋亡及EMT的影響A：敲低miR-145表達(dá)后MTT分析SW480細(xì)胞活力；B：敲低miR-145表達(dá)后細(xì)胞克隆形成實(shí)驗檢測SW480細(xì)胞克隆數(shù)目；C：敲低miR-145表達(dá)后Western blot檢測細(xì)胞EMT；D：敲低miR-145表達(dá)后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況

2.5LncRNA KCNQ1OT1表達(dá)上調(diào)通過miR-145對SW480細(xì)胞增殖、凋亡及EMT的影響：上調(diào)KCNQ1OT1表達(dá)后細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞克隆數(shù)目、N-cadherin/GAPDH比值顯著高于對照組(P<0.05)，E-cadherin/GAPDH比值和細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組(P<0.01)；上調(diào)miR-145表達(dá)后細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞克隆數(shù)目、N-cadherin/GAPDH比值顯著低于對照組(P<0.05)，E-cadherin/GAPDH比值和細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01)；KCNQ1OT1與miR-145同時上調(diào)組細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞克隆數(shù)目、N-cadherin/GAPDH比值顯著高于miR-145單獨(dú)上調(diào)組(P<0.05)，E-cadherin/GAPDH比值和細(xì)胞凋亡率顯著低于miR-145單獨(dú)上調(diào)組(P<0.01)，見圖5和表6。

表6 LncRNA KCNQ1OT1表達(dá)上調(diào)通過miR-145對SW480細(xì)胞增殖凋亡及EMT的影響

圖5 LncRNA KCNQ1OT1表達(dá)上調(diào)通過miR-145對SW480細(xì)胞增殖、凋亡及EMT的影響A：上調(diào)LncRNA KCNQ1OT1和miR-145表達(dá)后MTT分析SW480細(xì)胞活力；B：調(diào)LncRNA KCNQ1OT1和miR-145表達(dá)后細(xì)胞克隆形成實(shí)驗檢測SW480細(xì)胞克隆數(shù)目；C：調(diào)LncRNA KCNQ1OT1和miR-145表達(dá)后Western blot檢測細(xì)胞EMT；D:調(diào)LncRNA KCNQ1OT1和miR-145表達(dá)后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA參與了許多細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展過程，且LncRNA在癌癥中的作用也得到了進(jìn)一步證實(shí)。目前，許多作為內(nèi)源性miRNA海綿的lncRNA已經(jīng)被證明參與了CRC的惡性發(fā)展。如研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG11作為結(jié)直腸癌早期診斷和預(yù)后的新型生物標(biāo)志物[8]。長鏈非編碼RNA GAS5通過與YAP磷酸化和降解相互作用并觸發(fā)YAP磷酸化和降解而抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展。此外還發(fā)現(xiàn)LncRNA SNHG6通過靶向UPF1激活TGF-β/Smad信號通路，通過調(diào)控ZEB1誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[9]。鑒于LncRNA在結(jié)直腸癌發(fā)展中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，揭示LncRNA新的作用機(jī)制對于防控結(jié)直腸癌具有深遠(yuǎn)意義。有文獻(xiàn)報道LncRNA KCNQ1OT1參與了舌癌、胃癌等腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，此外還有研究發(fā)現(xiàn)LncRNA KCNQ1OT1在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，通過cAMP信號通路調(diào)控miR-760/PPP1R1B，增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對甲氨喋呤的耐藥[10]，表明LncRNA KCNQ1OT1與結(jié)直腸癌等腫瘤惡性發(fā)展息息相關(guān)。因此為了深入LncRNA KCNQ1OT1在結(jié)直腸癌的作用機(jī)制，本研究首先檢測了結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中LncRNA KCNQ1OT1的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)探討結(jié)直腸癌組織中KCNQ1OT1表達(dá)量高于癌旁組織，SW480細(xì)胞中KCNQ1OT1表達(dá)量高于CCC-HIE-2細(xì)胞，而本研究結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致，LncRNA KCNQ1OT1在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)。接下來研究LncRNA KCNQ1OT1的作用機(jī)制，敲低LncRNA KCNQ1OT1表達(dá)后，進(jìn)一步檢測了SW480細(xì)胞的增殖活力與EMT能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)其表達(dá)通過促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡顯著抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和EMT，LncRNA KCNQ1OT1在結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)展中發(fā)揮了明顯的抑癌作用，這與LncRNA KCNQ1OT1在舌癌、胃癌和膀胱癌中的功能相吻合。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)LncRNA通過靶向miRNA發(fā)揮作用，受此啟發(fā)，本研究預(yù)測了LncRNA KCNQ1OT1的下游作用靶點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA KCNQ1OT1與miR-145具有直接的靶向作用。miRNA是非編碼RNA家族的成員，在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，miRNA參與了腫瘤的形成和發(fā)展，提示它們可以發(fā)揮致癌或抑制腫瘤的作用。miR-145在癌癥發(fā)展過程中的作用機(jī)制在既往研究中得到越來越多的探討。Zhang等發(fā)現(xiàn)，miR-145通過抑制RAB5C在乳頭狀甲狀腺癌中發(fā)揮抑癌作用[11]。Li等發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細(xì)胞中，miR-145通過c-myc和dnmt3a介導(dǎo)的甲基化促進(jìn)miR-133b的表達(dá)。Wang等研究表明miR-145通過靶向ADAM19改變非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼的敏感性[12]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-145在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中顯著低表達(dá)，下調(diào)miR-145通過抑制SW480細(xì)胞凋亡顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖和EMT。以往的研究揭示了lncRNA-miRNA-mRNA軸在包括CRC在內(nèi)的各種癌癥中的不同調(diào)控機(jī)制。Xi等表明LncRNA LINC01278通過miR-134-5p/KDM2A軸加速大腸癌進(jìn)展[13]。Qian等研究發(fā)現(xiàn)lncRNA LUNAR1通過靶向miR-495-3p/MYCBP軸加速大腸癌進(jìn)展[14]。同樣，本研究證實(shí)了KCNQ1OT1的下調(diào)通過增加miR-145的表達(dá)來抑制PAK4的表達(dá)，從而抑制了SW480細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究進(jìn)一步闡明了KCNQ1OT1/miR-145/PAK4網(wǎng)絡(luò)在結(jié)直腸癌中的調(diào)控機(jī)制。盡管我們的發(fā)現(xiàn)為KCNQ1OT1的下游靶點(diǎn)提供了新的見解，未來需要進(jìn)行更多的研究，進(jìn)一步闡明生物標(biāo)志物的治療和預(yù)后價值。

綜上所述，本研究證實(shí)了lncRNA KCNQ1OT1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)顯著增加，并且KCNQ1OT1似乎通過調(diào)控miR-145/PAK4軸發(fā)揮致癌基因的作用。這些發(fā)現(xiàn)為早期檢測患者提供了一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物，也為CRC患者提供了一個潛在的治療靶點(diǎn)。