張慧宇白振軍李 亮張金鋒解佳偉鄧 亮孟 燕郭敏芳

(1.山西大同大學中醫(yī)藥健康服務學院,山西 大同 037009;2.山西大同大學醫(yī)學院,山西 大同 037009)

缺血性腦卒中占腦卒中的80%以上[1]。目前其主要的治療方法仍然是快速溶栓,但是在某些情況下存在缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)損傷[2]。損傷神經元周圍存在的抑制微環(huán)境是腦I/R損傷后神經功能修復困難的主要原因之一。神經生長抑制因子A(neurite outgrowth inhibitor A, NogoA)是構成這種抑制微環(huán)境的重要成分[3]。生理學上,NogoA信號通過其受體在少突膠質細胞和神經元的發(fā)育成熟、髓鞘形成、調節(jié)樹突棘形態(tài)和突觸可塑性從而調節(jié)大腦的學習和記憶等方面具有重要作用[4]。NogoA可以結合Nogo受體(Nogo receptor, NgR),使其下游的RhoA/Rho激酶(ROCK)通路激活,從而抑制軸突再生以及脊髓或腦損傷后的功能恢復[5]。有研究顯示,NogoA與神經細胞的凋亡密切相關,并且調節(jié)突觸的可塑性[6],在體內,阻斷NogoA可導致皮質錐體神經元的樹突棘密度增加,而抗NogoA抗體治療可以使由皮質控制精確運動的學習得到了改善,表明NogoA是一種重要的突觸可塑性調節(jié)劑,也是運動皮層熟練動作學習的調節(jié)器[7]。因此,消除腦I/R損傷后抑制神經再生過程的障礙,NogoA/RhoA/ROCK通路的下調非常重要。

由于溶栓治療的時間窗窄,并且存在I/R損傷和費用高等缺點。在各種卒中相關疾病的治療方法中,中草藥療法在古代醫(yī)學體系早有描述[8]。因此,眾多研究者致力于從中草藥中尋找有效的治療藥物。雷公藤甲素是從中草藥雷公藤中提取出來的活性成分,具有神經保護作用[9]。研究表明雷公藤甲素可以減輕腦I/R損傷[10-11],然而,關于雷公藤甲素改善腦I/R損傷的機制還有待深入研究。因此,本實驗選用人神經母細胞瘤細胞株(SHSY5Y),采用氧糖剝奪/復糖復氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)誘導其損傷,觀察雷公藤甲素對OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞的保護作用,并且基于NogoA/RhoA/ROCK信號通路探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 細胞

SH-SY5Y人源神經母細胞瘤細胞株由軍事醫(yī)學研究院軍事認知與腦科學研究所贈送。

1.2 主要試劑與儀器

雷公藤甲素(≥98%,貨號:DL0034)購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司;法舒地爾(批號:2007171)由天津紅日藥業(yè)公司提供;胎牛血清(貨號:16140063)、高糖DMEM培養(yǎng)基(貨號:21013024),無糖DMEM培養(yǎng)基(貨號:11966025)和青霉素-鏈霉素雙抗混合液(貨號:5140163)均購自美國Gibco公司;NogoA抗體(貨號:13401)、ROCK2抗體(貨號:47012)、突觸后密度蛋白-95(synaptic protein postsynaptic density 95, PSD-95)抗體(貨號:3450),Alex Flour?594和 Alex Flour?488標記的IgG二抗(貨號:8889、4412)均購自美國CST公司;NgR抗體(ab184556)購自英國Abcam公司;RhoA抗體(貨號:A0272)、神經元生長相關蛋白43(growth associatedprotein-43, Gap43)抗體(貨號:A6376)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的IgG二抗(貨號:AS014)均購自ABclonal公司;CCK8試劑盒(貨號:C0038)、JC-1試劑盒(貨號:C2003S)購自碧云天生物技術有限公司。

FV-1000激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司);HERAcell 150i三氣培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);H1M酶標儀(美國伯騰);SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)購(美國 Bio-Rad 公司);NanoDrop One超微量分光光度計(美國Thermo公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 CCK8法篩選TP濃度

用含10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)SY5Y細胞,常規(guī)傳代。將傳代細胞(每毫升5×103個)接種于96孔板中,于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后加入不同濃度的雷公藤甲素(0、0.1、1、10、50、100、500 nmol/L),每個濃度設5個復孔,藥物處理24 h按照說明書操作進行CCK8檢測,每孔加入20 μL CCK8溶液,CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,酶標儀檢測450 nm處的光密度值(OD值)。最后計算細胞活力,計算公式為(用藥孔OD值-調零孔OD值)/(對照孔OD值-調零孔OD值)×100%。選取可以增加細胞活性的雷公藤甲素濃度為實驗使用濃度。

1.3.2 OGD/R模型的建立及分組

將細胞分為4組:正常對照組、模型組、雷公藤甲素干預組(雷公藤甲素組)、Rho激酶抑制劑法舒地爾干預組(法舒地爾組)。模型組、雷公藤甲素組和法舒地爾組細胞進行OGD/R誘導損傷,細胞更換無糖DMEM培養(yǎng)基,雷公藤甲素組和法舒地爾組在更換無糖DMEM培養(yǎng)基后分別加入1 nmol/L雷公藤甲素和15 μg/mL法舒地爾,3組細胞置于三氣培養(yǎng)箱(94% N2、5% CO2、1% O2、37℃)中培養(yǎng)4 h,然后模型組更換為完全培養(yǎng)基,雷公藤甲素組和法舒地爾組分別更換含有1 nmol/L雷公藤甲素和15 μg/mL法舒地爾的完全培養(yǎng)基。37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。對照組細胞加完全培養(yǎng)基于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 細胞活性的檢測

細胞復糖復氧24 h后按照上述CCK8檢測方法檢測4組細胞的活性。細胞活性計算公式為(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。評估雷公藤甲素對OGD/R誘導的細胞損傷的保護效果。

1.3.4 線粒體膜電位的檢測

將細胞(1×104個/孔)接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿內,復糖復氧24 h后每孔加入1 mL JC-1工作液,37℃恒溫孵育20 min后用JC-1染色緩沖液洗滌,于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.5 免疫熒光染色

復糖復氧24 h后,將接種于24孔板內細胞爬片上的細胞用4%多聚甲醛固定1 h,PBS洗滌后用含有0.3% Triton X-100和1%牛血清白蛋白的封閉液室溫封閉1 h,加入一抗NogoA、ROCK2、GAP43(1∶1000),4℃過夜后加入594或488標記的山羊抗兔IgG二抗,室溫孵育2 h后用封片液封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.6 Western blot法檢測

復糖復氧24 h后,加入RIPA裂解液提取細胞蛋白質,使用超微量分光光度計進行蛋白定量并將各組蛋白濃度調齊。10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,然后將蛋白轉至PVDF膜,用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h,加入一抗GAPDH(1∶1000)或NogoA、NgR、RhoA、ROCK2、PSD-95、GAP43(1∶500),4℃過夜后加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶5000),室溫孵育2 h后TBST洗膜,最后用凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料以平均數±標準差(±s)來表示,所有實驗均重復3次。組間差異采用單因素方差分析,兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雷公藤甲素濃度篩選

CCK8結果顯示,當雷公藤甲素濃度≤10 nmol/L時,細胞受藥物影響小,細胞活力與對照孔相比差異無顯著性意義;當雷公藤甲素濃度≥50 nmol/L時,細胞活力下降,與對照孔相比差異有顯著性意義(P＜0.001),見表1?？梢娎坠偌姿貪舛仍凇?0 nmol/L時對細胞無毒性,而且雷公藤甲素濃度為0.1 nmol/L和1 nmol/L時可增加細胞活性,因此后續(xù)我們選擇雷公藤甲素濃度為1 nmol/L進行實驗。

表1 不同雷公藤甲素濃度對正常SH-SY5Y細胞活力的影響(n=5)Table 1 Effects of triptolide of different concentrations on the viability of normal SH-SY5Y cells

2.2 雷公藤甲素對細胞活性的影響

CCK8結果顯示,模型組的細胞活性較正常對照組明顯降低(P＜0.001);與模型組相比,雷公藤甲素組和法舒地爾組細胞活性有顯著性提高(P＜0.001)。并且雷公藤甲素組和法舒地爾組相比,細胞活性無顯著差異,見表2。

表2 雷公藤甲素對OGD/R損傷的SH-SY5Y細胞的保護作用(n=5)Table 2 Protective effect of triptolide on SH-SY5Y cells injured by OGD/R

2.3 雷公藤甲素對細胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位下降時JC-1產生綠色熒光;線粒體膜電位升高時JC-1產生紅色熒光。結果顯示,與正常對照組相比,模型組細胞的紅/綠熒光強度比值明顯下降(P＜0.001);與模型組比較,雷公藤甲素組和法舒地爾組細胞的紅/綠熒光強度比值均顯著增加(P＜0.001);雷公藤甲素組和法舒地爾組相比,紅/綠熒光強度比值無顯著差異見圖1。

圖1 雷公藤甲素對OGD/R損傷的 SH-SY5Y 細胞線粒體膜電位的影響Figure 1 Effect of triptolide on the mitochondrial membrane potential in SH-SY5Y cells injured by OGD/R

2.4 雷公藤甲素對突觸蛋白的影響

免疫熒光染色和Western blot結果顯示,與正常對照組相比,模型組細胞突觸相關蛋白GAP43和PSD-95的表達明顯下降(P＜0.001);與模型組比較,雷公藤甲素組和法舒地爾組細胞GAP43和PSD-95的表達均顯著升高(P＜0.05);雷公藤甲素組和法舒地爾組相比無顯著差異,具體內容詳見圖2。

圖2 雷公藤甲素對OGD/R損傷的SH-SY5Y 細胞突觸蛋白的影響Figure 2 Effect of triptolide on the expression of synaptic protein in SH-SY5Y cells injured by OGD/R

2.5 雷公藤甲素對NogoA/RhoA/ROCK信號通路蛋白的影響

免疫熒光染色和Western blot結果顯示,與正常對照組相比,模型組細胞NogoA、NgR、RhoA、ROCK2的表達均明顯增加(P＜0.001);與模型組比較,雷公藤甲素組和法舒地爾組細胞NogoA、NgR、RhoA、ROCK2的表達均下調(P＜0.001);雷公藤甲素組和法舒地爾組相比無顯著差異,見圖3。

圖3 雷公藤甲素對OGD/R損傷的SH-SY5Y 細胞NogoA/RhoA/ROCK信號通路蛋白的影響Figure 3 Effect of triptolide on the expression of NogoA/RhoA/ROCK signaling pathway protein in SH-SY5Y cells injured by OGD/R

3 討論

多項研究表明,雷公藤甲素可以改善腦I/R損傷,其機制可能與抑制氧化應激和神經炎癥、調節(jié)自噬、抗凋亡等有關[12-13]。因此雷公藤甲素可能成為腦卒中的潛在治療藥物。本實驗在體外建立SH-SY5Y細胞的OGD/R損傷模型,作為腦I/R損傷的細胞模型,觀察了雷公藤甲素對OGD/R損傷的SH-SY5Y細胞的保護效果。CCK8結果顯示OGD/R可以導致細胞活性降低,而雷公藤甲素干預增加了細胞活性,減輕了細胞損傷。JC-1染色顯示了同樣的結果,模型組細胞的線粒體膜電位下降,雷公藤甲素干預可以使線粒體膜電位升高。表明雷公藤甲素對 OGD/R誘導的細胞損傷具有保護效應。

GAP43是軸突生長錐的主要蛋白,被認為是軸突可塑性的內在決定因素,是軸突再生的主要標志物,參與神經元的分化、可塑性和再生[14]。GAP43表達增加可能是腦缺血后功能恢復的機制之一[15]。PSD-95是維持興奮性神經元突觸后密度區(qū)建立的關鍵,與神經元功能和存活密切相關,PSD-95蛋白可以通過對抗興奮性毒性為腦卒中提供神經保護作用,PSD-95水平增加可以促進突觸可塑性[16]。免疫熒光和Western blot結果均顯示,OGD/R損傷的 SH-SY5Y 細胞中GAP43和PSD-95的表達均減少,表明OGD/R在誘導細胞損傷的同時減弱了神經元突觸功能。而雷公藤甲素干預不僅可以減輕OGD/R誘導的細胞損傷,還可以使GAP43和PSD-95表達增加,促進突觸可塑性。

腦I/R損傷的病理生理過程極為復雜。而成人腦組織缺血缺氧后通過軸突再生或者代償性纖維生長來自我修復是極為有限且不完全的,原因有多方面,包括神經營養(yǎng)因子的減少、抑制性蛋白的產生、膠質瘢痕的形成等等,會形成抑制性微環(huán)境,從而限制受損神經元的結構可塑性[17]。其中NogoA作為軸突再生的主要障礙受到了廣泛關注。NogoA通過激活細胞內RhoA/ROCK通路,抑制軸突生長,阻礙神經再生和修復[18]。有研究顯示,在全腦缺血大鼠中,NogoA的表達在6 h顯著增加,持續(xù)7 d[19]。Eslamboli等[20]報告絨猴腦缺血后2個月內NogoA水平持續(xù)升高。并且在腦I/R損傷的動物模型腦組織中NogoA也表現為升高狀態(tài)[21-22]。因此。NogoA參與缺血性腦卒中的病理過程。而抗NogoA免疫療法可改善中樞神經損傷后的神經再生和神經可塑性,并改善腦卒中動物模型的預后[23]。還有研究顯示,腦I/R損傷大鼠腦組織中RhoA和ROCK基因和蛋白表達水平均顯著升高[24],而ROCK抑制劑法舒地爾可以刺激腦I/R損傷大鼠軸突再生并增加腦血流量[25]。這些結果均表明,抑制NogoA/RhoA/ROCK通路可能有助于I/R腦損傷的恢復。雖然有研究表明雷公藤甲素可以改善腦I/R損傷,但是其機制尚不明確。本研究結果顯示,與正常對照組相比,模型組細胞NogoA、NgR、RhoA和ROCK的表達均增加,與模型組相比,雷公藤甲素干預組細胞NogoA、NgR、RhoA和ROCK的表達均減少。我們同時采用了ROCK抑制劑法舒地爾對OGD/R損傷的SH-SY5Y細胞進行干預。觀察到雷公藤甲素對OGD/R損傷的SH-SY5Y細胞的保護作用與法舒地爾相當,法舒地爾干預同樣能使細胞活性和線粒體膜電位增加,并且使GAP43和PSD-95的表達增加,NogoA、NgR、RhoA和ROCK2的表達下調,并且和雷公藤甲素干預組相比沒有統(tǒng)計意義。這些結果均表明雷公藤甲素可能通過抑制NogoA/RhoA/ROCK通路發(fā)揮神經保護作用。

綜上所述,雷公藤甲素可能通過抑制神經元內NogoA/RhoA/ROCK通路的激活改善OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞損傷,并且促進突觸可塑性。此研究為深入探討雷公藤甲素對腦I/R損傷的保護作用以及作用機制奠定基礎。