陳錫龍，龔旭昊，孫真崢，王慶紅，謝麗麗，楊 強，趙 貴*

(1. 貴州省獸藥飼料檢測所，貴陽 550003：2. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

復方麻黃散臨床上主要用于治療肺熱咳喘，具有化痰止咳功能[1]。喹烯酮(quincetone)是中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研制開發(fā)的一種新型喹噁啉類抗生素，曾經主要作為飼料藥物添加劑被廣泛用于養(yǎng)殖生產中。自2020年1月1日起，農業(yè)農村部廢止僅有促生長用途的藥物飼料添加劑等品種質量標準，注銷相關獸藥產品批準文號和進口獸藥注冊證書，喹烯酮預混劑在列，標志著喹烯酮及其預混劑被禁用[2]。現(xiàn)在復方麻黃散中發(fā)現(xiàn)違規(guī)添加喹烯酮，違反了《獸藥管理條例》，給動物源性食品安全埋下隱患。同時，喹烯酮藥物殘留可能存在一定的致癌風險[3]。目前，農業(yè)農村部尚未發(fā)布獸藥中非法添加喹烯酮的檢查方法，因此，急需建立相關檢查方法，為嚴查使用喹烯酮提供技術支撐。近年來，陸春波、羅成江分別開展了喹乙醇預混劑及氟喹諾酮類藥物粉劑中非法添加喹烯酮的研究[4-5]，中獸藥制劑中喹烯酮的檢測方法尚未見報道。本試驗參考《獸藥質量標準》中喹烯酮的測定方法[6]，按照非特定非法添加物質檢查方法相關要求[7]，擬建立復方麻黃散中非法添加喹烯酮的HPLC-DAD檢查方法，可用于檢查復方麻黃散中非法添加喹烯酮。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Thermo Scientific U3000高效液相色譜儀(配DAD檢測器)；色譜柱為Hypersil GOLD C18(5 μm, 4.6 × 250 mm)色譜柱。XSR205DU型電子分析天平(感量0.01 mg，德國梅特勒托利多公司)；ME802E型電子分析天平(感量0.01 g，德國梅特勒托利多公司)；超聲波清洗器(KQ-300DE，昆山市超聲儀器廠)。甲醇為色譜純，水為超純水，N,N-二甲基甲酰胺為分析純。

1.2 試藥 喹烯酮對照品(含量：99.9%，批號：H0561704，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；空白制劑：自制復方麻黃散(取麻黃100 g，桔梗100 g，薄荷40 g，黃芪10 g，氯化銨100 g。前4味粉碎，過4號標準篩，與研成細粉的氯化銨混勻，即得。所需中藥均購自正和祥藥業(yè)有限公司)；供試品：復方麻黃散(批號：20200501，經檢測含有喹烯酮)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱為固定相；以甲醇-水(60∶40，V∶V)為流動相；流速為1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫30 ℃，二極管陣列檢測器檢測，采集波長范圍為190～400 nm，分辨率為1.0 nm；記錄波長314 nm處的色譜圖，同時記錄光譜圖。

2.2 溶液配制

2.2.1 復方麻黃散制劑空白溶液 取空白制劑1.0 g，置20 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL，塞上塞子，超聲處理10 min，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；另取2.00 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為復方麻黃散制劑空白溶液。

2.2.2 喹烯酮對照品貯備液的配制 取喹烯酮對照品約10 mg，置20 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.5 mg/mL的對照品貯備液。

2.2.3 喹烯酮對照品溶液的配制 精密量取喹烯酮對照品貯備液2 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為50 μg/mL的對照品溶液。

2.2.4 供試品溶液的配制 取供試品1.0 g，置20 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL，塞上塞子，超聲處理10 min，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；另取2.00 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.5 陽性添加樣品溶液的配制 取制劑空白樣品1.0 g，置20 mL量瓶中，按高(H)、中(M)、低(L)三個濃度水平分別加入10、8和6 mg喹烯酮，混勻，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL，塞上塞子，超聲處理10 min，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；另取2.00 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為陽性添加樣品溶液。

2.2.6 檢測限溶液的配制 取制劑空白樣品1.0 g，置20 mL量瓶中，分別加入0.5 mg/mL的喹烯酮對照品貯備液0.25 mL、0.5 mL和1.0 mL，混勻，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL，塞上塞子，超聲處理10 min，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；分別另取2.00 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.7 建立光譜數(shù)據(jù)庫的溶液 以喹烯酮對照品溶液作為建立光譜數(shù)據(jù)庫的溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性 通過復方麻黃散制劑空白、供試品和陽性添加樣品試驗排除制劑中的主要成分和輔料對被測物的干擾[8]。分別精密量取2.2.1項下的復方麻黃散制劑空白溶液、2.2.4項下的供試品溶液和2.2.5項下的高濃度水平陽性添加樣品溶液各10 μL，按2.1項下的色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖1。結果表明，供試品與陽性添加樣品色譜圖中，喹烯酮峰的保留時間一致，復方麻黃散制劑空白在喹烯酮相應保留時間處無干擾峰。試驗結果說明方法專屬性良好。

a. 復方麻黃散制劑空白 b.供試品 c. 陽性添加樣品(10 mg/g)圖1 專屬性考察色譜圖Fig 1 The chromatogram of specific inspection

2.3.2 峰純度和光譜相似度檢查 通過供試品和喹烯酮對照品溶液試驗進行峰純度和光譜相似度檢查。分別精密量取2.2.4項下的供試品溶液和2.2.3項下的喹烯酮對照品溶液各10 μL，按2.1項下的色譜條件，注入高效液相色譜儀，采集3D數(shù)據(jù)，記錄光譜圖(圖2)。結果表明，峰純度分析顯示，供試品和對照品峰匹配(表示峰最大值處的光譜與前沿和拖尾上光譜的相似度)值均為1000(匹配值大于980可以基本確認是同一組分)，說明喹烯酮峰為單一組分。經目測比較，可知供試品和對照品光譜圖一致(最大吸收波長偏差不超過2 nm)?；蛘?，通過執(zhí)行光譜跟蹤把供試品和對照品的光譜圖與用喹烯酮對照品溶液建立的光譜庫進行匹配，相似度閾值設為980，可知供試品和對照品與喹烯酮光譜庫的相似度分別為1000.00和999.98，即它們的紫外光譜一致。

2.3.3 線性關系考察 精密量取喹烯酮對照品貯備液適量，加甲醇制成2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL的標準曲線系列溶液，測定，每個濃度水平進樣兩次。以喹烯酮峰面積Y為縱坐標，相應濃度X為橫坐標，繪制標準曲線。回歸方程為：Y=1.1969X+0.055，R2=0.9999。結果表明，喹烯酮在2.0～100.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.4 檢測限 通過對復方麻黃散制劑空白樣品添加喹烯酮對照品溶液考察方法的檢測限。按2.2.6項下配制檢測限溶液進行測定。以光譜圖未失真的最低添加濃度作為方法的檢測限，即加入0.5 mg/mL喹烯酮對照品貯備液0.5 mL的制劑空白樣品溶液所對應的樣品的喹烯酮添加量即為方法的檢測限，結果見圖3。結果表明復方麻黃散制劑檢查喹烯酮的檢測限為0.25 g/kg。

圖3 檢測限溶液色譜圖和光譜圖Fig 3 Chromatogram and spectrum of the LOD solution

2.3.5 準確度 通過對復方麻黃散制劑空白樣品添加喹烯酮對照品進行回收率試驗考察方法的準確度。按2.2.5項下每個濃度水平分別平行配制3份陽性添加樣品溶液，進行測定，每個平行進樣2次，計算回收率，結果見表1。結果表明，復方麻黃散制劑空白樣品添加喹烯酮的平均回收率為101.4%，RSD=0.5%。

表1 回收率試驗結果Tab 1 The results of recovery test

2.3.6 耐用性 以高濃度水平陽性添加樣品溶液作為耐用性試驗溶液，改變柱溫、流速、流動相比例及更換不同品牌的色譜柱(4.6×250 mm, 5 μm)四個方面考察方法的耐用性。試驗結果表明，當柱溫升高、流速增加、流動相中有機相比例提高時，保留時間會提前；使用相同規(guī)格性能相近的不同品牌的色譜柱時，保留時間會發(fā)生變化。但上述情況下分離度均滿足檢測要求，說明方法耐用性良好。

2.3.7 樣品測定 按2.2.4項下配制供試品溶液進行測定。供試品溶液在與喹烯酮對照品溶液主峰保留時間一致處有色譜峰出現(xiàn)；峰純度分析顯示峰匹配值為1000，為單一組分。峰跟蹤顯示該色譜峰與標準庫中喹烯酮色譜峰相似度為999.99；兩者紫外光譜圖及最大吸收波長均一致。故判定供試品中含喹烯酮，并測得其含量為9.3 g/kg。

3 討論與小結

3.1 復方麻黃散制劑非法添加喹烯酮的發(fā)現(xiàn) 在進行獸藥非法添加物篩查時，本試驗使用自建方法進行檢測時，發(fā)現(xiàn)某復方麻黃散制劑疑似添加喹烯酮，經過復方麻黃散制劑空白試驗及陽性添加試驗進一步得到確認。

3.2 色譜條件、提取波長和檢測器的選擇 本試驗中采用的色譜條件和提取波長，均參照《獸藥質量標準》2017年版化學藥品卷喹烯酮的液相色譜含量測定方法建立，為對目標物進行準確定性，采用二極管陣列檢測器檢測。

3.3 提取條件的優(yōu)化 本試驗的提取溶劑同樣參照《獸藥質量標準》2017年版化學藥品卷喹烯酮的液相色譜含量測定，考慮到樣品基質的復雜性，故對樣品超聲處理10 min，確保喹烯酮被充分提取。比較而言，陸春波等[4]用甲醇提取喹乙醇預混劑中的喹烯酮，方法較簡單便捷；羅成江等[5]用0.3%的磷酸溶液(取磷酸3.0 mL加水1000 mL，用三乙胺調pH值至3.0，加乙腈 50 mL)提取氟喹諾酮類藥物粉劑中非法添加的喹烯酮等藥物，有利于分離測定氟喹諾酮及喹噁啉類藥物，有較好的適用性和針對性。

3.4 進樣量的選擇 試驗在不改變其他色譜條件的情況下，采用喹烯酮對照品溶液作為試驗溶液，分別對三款不同品牌的色譜柱進樣20、10和5 μL，結果表明，進樣量為20 μL時，色譜峰峰形變差，故選擇10 μL作為進樣量。

建立了復方麻黃散中非法添加喹烯酮的HPLC-DAD檢查方法，通過專屬性、線性關系、檢測限、準確度、耐用性考察表明可準確定量，結合保留時間、紫外吸收光譜、峰純度分析可準確定性識別。方法簡單、快速、準確，可用于檢查復方麻黃散中非法添加喹烯酮。