趙玉龍，何平有，劉明超，劉 濤,3，焦玉蘭,3*

(1.瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，河北保定 071000；2. 河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定 071000；3. 河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北保定 071000)

豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis of swine, TGE)和豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是常見的主要侵染豬腸道的高度接觸性傳染病，常發(fā)生在冬春季，是豬的常見病，尤其對仔豬危害嚴重[1-2]，臨床表現(xiàn)為哺乳仔豬的急性腸炎、嘔吐、腹瀉和高死亡率[3]。

目前，疫苗免疫仍是防控該類疫病的主要手段[4]。市場化的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)弱毒凍干活疫苗，其毒力穩(wěn)定、安全，對仔豬免疫效力確實[5]，但在疫苗生產(chǎn)和使用中仍存在一些問題：一是半成品病毒液保存時間短(-20 ℃保存期僅2個月)；二是凍干活疫苗保存條件高(需在-20 ℃保存，保存期18個月)，疫苗儲運過程不穩(wěn)定，影響免疫效果[6]。疫苗保護劑的成分及其制備、凍干工藝是影響疫苗效果的重要因素，對疫苗保存、運輸及免疫效果有很大影響，本研究擬開發(fā)一種新型病毒保護劑，提高對病毒保護效果，提升疫苗質(zhì)量。

本試驗通過在常規(guī)保護劑(明膠、蔗糖)基礎(chǔ)上添加卡波姆、硫酸鋅、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等基質(zhì)，組成新型保護劑，分別在病毒液保存和疫苗凍干過程添加，通過對病毒液保存效果和疫苗常規(guī)檢驗以及病毒含量、安全性、免疫攻毒保護效果及耐老化試驗等項目的對比研究，評價了新型保護劑病毒保護效果。

1 材 料

1.1 病毒液 疫苗毒株為豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)HB08株、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)ZJ08株。豬傳染性胃腸炎半成品病毒液500 mL、豬流行性腹瀉半成品病毒液500 mL，均由瑞普公司生產(chǎn)部提供。

1.2 疫苗保護劑成分 蔗糖、聚乙二醇購自天津市科密歐化學試劑有限公司；明膠、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆、硫酸鋅購自默克公司。

1.3 試驗動物 5日齡豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉病毒抗體陰性健康仔豬，購自河北省某養(yǎng)殖場。

2 方 法

2.1 疫苗制備

2.1.1 保護劑的制備 試驗用新型保護劑配方：10%明膠、50%蔗糖、5%卡波姆、1%硫酸鋅、5%聚乙二醇、5%聚乙烯吡咯烷酮；常規(guī)保護劑配方：10%明膠、50%蔗糖。

2.1.2 病毒液制備 豬傳染性胃腸炎半成品病毒液、豬流行性腹瀉半成品病毒液均由瑞普公司生產(chǎn)部按照《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2323號》(下文簡稱《公告2323號》)半成品操作規(guī)程制備，病毒含量符合公告質(zhì)量標準。

2.1.3 配苗、分裝及凍干 按表1分組及操作方法進行配苗、分裝及凍干。

2.2 保護劑保存及凍干效果評估

2.2.1 新型保護劑對病毒液保存效果的影響 按照表2分組方法進行病毒液保存效果試驗。

2.2.2 凍干活疫苗常規(guī)項目及純凈性檢驗 按照《中華人民共和國獸藥典2020年版三部》(下文簡稱《中國獸藥典》)標準進行檢驗。

2.2.3 凍干活疫苗效力檢驗(病毒含量測定) 按照《公告2323號》標準進行檢驗。

2.2.4 凍干活疫苗免疫攻毒保護試驗(測定攻毒保護效果) 按表3分組方法進行攻毒保護試驗。

2.2.5 凍干活疫苗安全試驗 按表4分組方法進行安全試驗。

表1 疫苗分裝、凍干試驗操作Tab 1 Experimental operating method of loading and lyophilization

表2 病毒液保存效果試驗Tab 2 Experiment on preservation effect of disease venom

表3 攻毒保護試驗Tab 3 Challenge protection experiment

表4 安全試驗Tab 4 Experimental operating method of safety inspection

2.2.6 凍干活疫苗耐老化試驗 凍干后各組疫苗隨機抽取30支，分別置37 ℃保存15 d，分別測定病毒含量。

2.2.7 凍干活疫苗保存期試驗 疫苗保存條件由原來-20 ℃保存改為2～8 ℃保存，常規(guī)保護劑凍干活疫苗和新型保護劑凍干活疫苗保存0、6、12、24和36個月，分別測定病毒含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 病毒液添加新型保護劑凍存效果驗證 如表5所示，未添加保護劑的病毒液-20 ℃僅保存2個月。添加新型保護劑的病毒液在-20 ℃保存12個月后，病毒含量均無明顯變化，TGEV病毒含量僅下降0.34個滴度，PEDV病毒含量僅下降0.54個滴度。

表5 病毒液保存效果試驗結(jié)果Tab 5 Experimental results of preservation effect of disease virus content TCID50/mL

3.2 凍干后常規(guī)項目及純凈性檢驗結(jié)果 如表6所示，兩種凍干保護劑活疫苗，物理性狀、真空度、剩余水分和無菌檢驗結(jié)果均符合《中國獸藥典》質(zhì)量標準。在溶解性方面新型凍干保護劑活疫苗明顯優(yōu)于常規(guī)保護劑活疫苗。

表6 常規(guī)項目及純凈性檢測結(jié)果Tab 6 Routine tests and purity test results

3.3 凍干活疫苗效力試驗(病毒含量測定) 如表7所示，新型保護劑活疫苗TGEV部分效力較常規(guī)保護劑活疫苗高0.43個滴度，PEDV部分效力高0.6個滴度。

表7 效力試驗結(jié)果

3.4 凍干活疫苗免疫攻毒保護試驗、安全試驗結(jié)果 如表8所示，新型保護劑疫苗保護效果優(yōu)于常規(guī)保護劑。新型保護劑活疫苗可提供9.67/10保護，常規(guī)保護劑活疫苗免疫攻毒保護為8.33/10；對照組0/10保護。

表8 攻毒保護及安全試驗結(jié)果Tab 8 Challenge protection and safety test results

3.5 凍干活疫苗耐老化試驗結(jié)果 如表9所示，新型保護劑活疫苗37 ℃保存15 d，其TGEV部分病毒含量降低0.8個滴度，PEDV部分病毒含量降低0.9個滴度；而常規(guī)保護劑活疫苗病毒含量迅速下降，37 ℃保存期不足5 d。

表9 耐老化試驗結(jié)果(37 ℃保存)

3.6 凍干活疫苗保存期試驗結(jié)果 如表10所示，新型耐熱保護劑活疫苗2～8 ℃保存36個月, TGEV部分病毒含量降低0.3個滴度，PEDV部分病毒含量降低0.5個滴度，且病毒含量高于農(nóng)業(yè)部公告質(zhì)量標準(≥5.0 lg(TCID50/頭份)，在冷藏條件下保存期可長達36個月；常規(guī)保護劑活疫苗2～8 ℃保存期僅為6個月。

表10 保存期試驗結(jié)果(2～8 ℃保存)

4 結(jié)論與討論

高效價的半成品病毒液是生物制品穩(wěn)定生產(chǎn)的基礎(chǔ)。多年的生產(chǎn)實踐證明，-20 ℃左右低溫保存的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉半成品的效價保存期僅為2個月，對后期成品生產(chǎn)及質(zhì)量影響很大。近年來本課題組試圖查閱文獻，尋找解決辦法。所閱文獻多為-20 ℃以下保存，-15 ℃及以上保存的研究鮮有報道。本試驗通過在半成品保存環(huán)節(jié)添加新型冷凍保存液，使半成品保存期在-15 ℃～-18 ℃環(huán)境下由原來的2個月延長到12個月，確保實現(xiàn)常溫化苗，提升了病毒穩(wěn)定性和活性、為生產(chǎn)調(diào)度贏得了時間。

選用合適的保護劑對疫苗的質(zhì)量和長期保存的穩(wěn)定性至關(guān)重要[7]。市場上現(xiàn)有的腹瀉二聯(lián)活疫苗通常為蔗糖、明膠等保護劑，組方簡單、保護功能差，2～8 ℃可以冷藏運輸、但-15 ℃以下保存期是其兩倍[8]，說明其冷藏保存穩(wěn)定性尚待進一步研究。

本研究在原有明膠、蔗糖基礎(chǔ)上添加了PEG、聚乙烯吡咯烷酮等基質(zhì)，可有效減小病毒在凍干過程中凍干損失，較常規(guī)保護劑提升了0.4～0.6個滴度，大分子冷凍保護劑與小分子冷凍保護劑聯(lián)合使用，顯著提升了病毒活性與穩(wěn)定性。同時，醫(yī)藥級PEG[9-10]和聚乙烯吡咯烷酮溶解性能良好，可與多種藥物相溶，提高生物利用度。聚乙烯吡咯烷酮還具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[11]。本試驗保護劑中通過添加PEG和聚乙烯吡咯烷酮，充分利用了二者優(yōu)異的溶解性和熱穩(wěn)定，加速了疫苗溶解度，保護了病毒的抗原性，提高了產(chǎn)品在保存和使用中的穩(wěn)定性。

本研究在組方中添加PEG、卡波姆和硫酸鋅等制備的疫苗具有良好的耐熱效果，在2～8 ℃環(huán)境保存36個月，效價僅下降0.3個滴度。研究者認為，卡波姆與PEG對冠狀病毒具有良好的保護作用，二者在凍干過程中可形成獨特的雙層結(jié)構(gòu)，包裹在病毒表面形成一種天然屏障，有效阻隔冷凍過程冰晶對病毒囊膜的損傷，另一方面內(nèi)側(cè)的疏水區(qū)結(jié)構(gòu)與病毒嵌合增加病毒自身的穩(wěn)定性，有效保存病毒的活性。李晏[12]表明卡波姆作為一種高分子聚合物，可促進冷凍干燥過程中的升華，使懸浮于耐熱保護劑中的病毒在冷凍干燥過程中能保持存活狀態(tài)；硫酸鋅也具有增強病毒自身穩(wěn)定性的功能。侯若鑫等[13-14]表明鋅是機體多種酶的重要組成成分和激活因子，能夠參與細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和代謝增殖，在細胞生長、免疫功能和營養(yǎng)代謝等生理或病理過程中起著關(guān)鍵作用。

綜上所述，本試驗在半成品病毒液儲存時加入含卡波姆等基質(zhì)的新型保護劑, 可有效延長半成品保存期，保證半成品病毒在常溫狀態(tài)下生物學活性的維持，實現(xiàn)了常溫直接融化疫苗半成品，生產(chǎn)工序更簡化，且降低了能耗。同時降低了病毒保存和凍干過程中的損傷，采用新型保護劑制備的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗，實現(xiàn)了儲運過程中疫苗冷藏保存，提升了疫苗運輸過程中的穩(wěn)定性；且保存期由原來-20 ℃保存24個月延長到2～8 ℃保存36個月。