周新新，朱鶴云，范琢玉,2，李樂樂，林曉影，馮 波，崔 悅*，關(guān) 皎*

(1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院，吉林吉林 132013；2. 延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉 133002)

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種或甜橙(CitrussinensisOsbeck)的干燥幼果，為藥食同源中藥，主要分布在四川、湖南等地[1-2]。文獻(xiàn)報(bào)道，枳實(shí)具有多種藥理作用，包括促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)[3-5]、抗氧化[6]、抗菌[7]等。其作為脾胃藥，被獸醫(yī)用于治療動(dòng)物便秘、胃積食、胃阻塞等[8-10]，主要活性成分為黃酮類，如柚皮苷、新橙皮苷等[1]。藥材的提取有多種方法，其中超聲法較經(jīng)典且應(yīng)用廣泛[11]。閃式提取法則是一種新興的提取方法，具有省時(shí)、高效等優(yōu)點(diǎn)[12-15]。目前，尚未見超聲法和閃式提取法提取枳實(shí)總黃酮的對(duì)比研究。本文以柚皮苷和新橙皮苷總提取率作為枳實(shí)總黃酮提取率[總黃酮的提取率(%)=提取液中總黃酮的含量/藥材質(zhì)量×100%]為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)分別優(yōu)選出兩種方法的最佳工藝并比較，最終確定枳實(shí)總黃酮的最佳提取工藝，為枳實(shí)在獸藥新藥開發(fā)領(lǐng)域和飼料工業(yè)化生產(chǎn)方面提供一定依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器 超高快速液相色譜儀(Prominence UFLC)：日本島津公司；微型萬能粉碎機(jī)(FW80)：天津市泰斯特儀器有限公司；閃式提取器(JHBE-50S)：河南金鼐科技發(fā)展有限公司；超聲波清洗器(KQ-500GVDV)：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 材料 枳實(shí)藥材購自吉林市吉林大藥房；柚皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司(純度>98%，批號(hào)：110730-201614，110729-201714)；無水乙醇為分析純，購自永大化學(xué)試劑有限公司；甲醇為色譜級(jí)，購自美國Fisher公司。

2 方 法

2.1 枳實(shí)總黃酮含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱采用Shim-pack XR-ODS柱(3.0×75 mm，2.2 (m，SHIMADZU)，流動(dòng)相采用0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序如下：0-10 min，20-30%，檢測波長為265 nm，流速為0.4 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為5 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取柚皮苷和新橙皮苷對(duì)照品適量，以甲醇為溶劑制得兩種成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液分別為280 μg/mL和560 μg/mL。

2.1.3 供試品溶液的制備

2.1.3.1 超聲法 稱取枳實(shí)藥材粉末0.5 g于50 mL具塞錐形瓶中，加入50%乙醇35 mL，提取功率200 W，時(shí)間75 min。所得濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3.2 閃氏提取法 稱取枳實(shí)藥材粉末0.5 g于容器中，加入50%乙醇35 mL，提取時(shí)間3 min，其余操作同“2.1.3.1”，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別取柚皮苷和橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，以用甲醇為溶劑配制兩種成分的系列混合對(duì)照品溶液。柚皮苷濃度為3.5、7、17.5、35、70、140 μg/mL，新橙皮苷濃度為7、14、35、70、140、280 μg/mL

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以待測物峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)建立線性回歸方程。

2.1.5.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液(柚皮苷35 μg/mL，新橙皮苷70 μg/mL)適量，按上述色譜條件連續(xù)注入色譜儀中(n=6)，計(jì)算兩種成分峰面積的RSD。

2.1.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批枳實(shí)藥材粉末制備供試品溶液。置于室溫條件下，分別于0、2、8、12、24 h取樣品分析，計(jì)算兩種成分峰面積的RSD。

2.1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批枳實(shí)藥材粉末6份分別制備供試品溶液。進(jìn)樣分析并計(jì)算兩種成分峰面積的RSD。

2.2 提取工藝

2.2.1 超聲法 稱取枳實(shí)藥材粉末于提取容器中，按料液比(g/mL，枳實(shí)質(zhì)量/溶劑體積)1∶70加入50%乙醇，提取功率設(shè)為200 W，提取75 min。

2.2.2 閃式提取法 稱取枳實(shí)藥材粉末于提取容器中，按料液比(g/mL，枳實(shí)質(zhì)量/溶劑體積)1∶70加入50%乙醇，提取3 min。

2.3 工藝比較 按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定并比較兩種方法枳實(shí)總黃酮的提取率，確定最佳提取工藝。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件的建立 混合對(duì)照品溶液、枳實(shí)樣品溶液色譜圖如圖1所示。

1. 柚皮苷；2. 新橙皮苷1. naringin; 2. neohesperidin圖1 混合對(duì)照品溶液(A)和枳實(shí)樣品溶液(B)色譜圖Fig 1 Chromatograms of mixed reference solution (A) and Aurantii Fructus Immaturus sample solution (B)

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 柚皮苷為Y=1.290×104X+1.659×104(r=0.9998)，新橙皮苷為Y=9.098×103X+2.397×103(r=0.9999)。兩種成分的線性范圍分別為3.5～140 μg/mL，7～280 μg/mL。

3.2.2 精密度試驗(yàn) 兩種成分峰面積的RSD分別為1.1%和1.0%，表明儀器具有良好的精密度。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 兩種成分峰面積的RSD分別為0.8%和0.7%，結(jié)果表明枳實(shí)樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 兩種成分峰面積的RSD分別為0.9%和1.1%，表明本方法具有良好的重復(fù)性。

3.3 提取工藝

3.3.1 超聲法的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別以乙醇濃度(A)、時(shí)間(B)、功率(C)和料液比(D)作為考察因素，按表1設(shè)計(jì)試驗(yàn)。超聲法正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析結(jié)果如表2和表3所示，各因素對(duì)提取工藝的影響順序?yàn)?A(乙醇濃度)>C(功率)>D(液料比)>B(時(shí)間)且各因素對(duì)提取工藝均無顯著性差異，最佳工藝為 A1B3C2D3，即用50%乙醇，按料液比1∶70以200 W功率提取75 min。

表1 超聲法正交試驗(yàn)因素水平表Tab 1 Factors level table of orthogonal test of ultrasonic method

表2 超聲法正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Orthogonal test results of ultrasonic method

表3 超聲法方差分析結(jié)果Tab 3 Analysis results of ultrasonic method square difference

3.3.2 閃式提取法的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別以乙醇濃度(A)、料液比(B)和時(shí)間(C)作為考察因素，按表4設(shè)計(jì)試驗(yàn)。閃式提取法正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析結(jié)果如表5和表6所示，各因素對(duì)提取工藝的影響順序?yàn)?A(乙醇濃度)>B(液料比)>C(時(shí)間)且各因素對(duì)提取工藝均無顯著性差異，最佳工藝為 A1B3C3，即用50%乙醇，按料液比1∶70提取3 min。

表4 閃式提取法法正交試驗(yàn)因素水平表Tab 4 Factors level table of orthogonal test of flash extraction method

表5 閃式提取法正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Orthogonal test results of flash extraction method

表6 閃式提取法方差分析結(jié)果Tab 6 Square difference analysis results of flash extraction method

3.4 工藝比較 如表7所示，兩種方法枳實(shí)總黃酮的最佳提取工藝均為50%乙醇和1∶70的料液比，超聲法提取率(25.26%)高于閃式提取法(18.65%)，但超聲法所用時(shí)間(75 min)為閃式提取法(3 min)的25倍。

表7 不同提取方法枳實(shí)總黃酮的提取率Tab 7 The extraction rates of total flavonoids from AurantiiFructus Immaturus by different extraction technologies

4 討論與結(jié)論

枳實(shí)中含有豐富的黃酮類化合物，其中柚皮苷和新橙皮苷的含量最高且較穩(wěn)定[16]，因此，本實(shí)驗(yàn)以柚皮苷和新橙皮苷提取率之和作為枳實(shí)總黃酮提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)。文獻(xiàn)報(bào)道，柚皮苷作為飼料添加劑可以調(diào)節(jié)和控制脂肪代謝、提高肉質(zhì)、提高動(dòng)物機(jī)體免疫力[17-18]；新橙皮苷能夠促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)[19]。枳實(shí)是一種應(yīng)用價(jià)值很高的中獸藥，合理的提取工藝對(duì)于枳實(shí)在畜牧和動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的開發(fā)和利用具有重要意義。隨著提取工藝的不斷進(jìn)步，未來枳實(shí)總黃酮的提取將更加快速、高效。

單因素試驗(yàn)中分別考察了乙醇濃度、提取時(shí)間、液料比和提取功率等因素；采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)分別優(yōu)化并比較了超聲法和閃式提取法枳實(shí)總黃酮的最佳提取工藝。兩種方法最佳工藝乙醇濃度、料液比均相同。超聲法的提取率為25.26%，閃式提取法的提取率為18.65%，但超聲法所用時(shí)長為閃式提取法的25倍。綜合考慮枳實(shí)總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)對(duì)時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本的要求，閃式提取法更加省時(shí)、簡單和快速，適于大規(guī)模的獸藥工業(yè)化生產(chǎn)。最終確定閃式提取法為枳實(shí)總黃酮的最佳提取方法，其提取工藝為：50%乙醇，料液比1∶70，提取3 min。