郭曉蕾，王友保

（1.安徽師范大學 生態(tài)與環(huán)境學院，安徽 蕪湖 241002；2.廈門大學 環(huán)境與生態(tài)學院，福建 廈門 361102）

隨著采礦和冶金等行業(yè)的快速發(fā)展，土壤重金屬污染狀況日益嚴重[1]。例如，銅礦區(qū)礦業(yè)活動會造成重金屬銅進入周邊水體和土壤，破壞土壤結構與營養(yǎng)，破壞生物生存環(huán)境，進而危害人類健康[2]。研究表明，植物體內過量的銅會危害植物種子萌發(fā)與幼苗生長，其中植物根系與土壤接觸最為密切，會最先受到銅毒害，進而使植物的生長發(fā)育受到影響[3]。適當增加植物生長環(huán)境的磷含量可以加速植物生長并提高產量，因為磷可促進根系快速生長，并使植物更早地獲得生長所需的資源[4]。過量施用磷肥反而會造成植物損傷[5]，適當施加磷肥才會對植物生長發(fā)育有益，尤其是可以促進植物根系發(fā)育和提高植物的抗逆性[6-7]。

波斯菊（Cosmos bipinnatusCav.）別名秋英、大波斯菊，為菊科秋英屬一年生或多年生草本花卉，喜光，可以耐受貧瘠的土壤，生命力旺盛。作為一種常見的觀賞花卉，波斯菊已廣泛應用于城市園林綠化中。研究證實，波斯菊能夠在一定程度的重金屬脅迫下生存[8]，而添加適宜濃度的外源磷可有效緩解植物受重金屬脅迫所導致的生長發(fā)育不良癥狀[9]?；诖?，本文研究了不同濃度的磷對銅脅迫下波斯菊種子萌發(fā)與幼苗生長的影響，以期揭示波斯菊的銅脅迫響應機制，并為更好地利用其修復重金屬污染土壤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試波斯菊種子購自于山東濟南匠人花海；實驗所用的磷為KH2PO4，銅為分析純CuSO4·5H2O。

1.2 實驗方法

選取飽滿無殘缺的波斯菊種子，先用10%次氯酸鈉溶液消毒10 min，然后用蒸餾水反復沖洗干凈，最后用濾紙吸干種子表面水分備用。將消毒后的種子均勻地放于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿內，每皿30粒。參照陳天等的方法[9]，設置3個KH2PO4水平（0、2和20 mg/L，以P濃度計算），并以霍格蘭營養(yǎng)液配置Cu-SO4濃度梯度溶液（0、10、50、100、200、250 mg/L，以Cu2+濃度計算），共18個處理，分別對各組種子添加不同濃度的溶液，每個處理設置3個平行。于25°C智能光照培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每天補充適量相應濃度的重金屬溶液，使濾紙和種子保持濕潤狀態(tài)，且濾紙周圍不出現(xiàn)任何水膜。若種子出現(xiàn)發(fā)霉則及時移出，必要時則更換培養(yǎng)皿和濾紙。

1.3 測定項目

實驗周期共12 d。從第3 d 開始，連續(xù)每天記錄種子發(fā)芽數(shù)（標準為波斯菊種子的芽長等于種子長度的1/2），并計算發(fā)芽勢和相對發(fā)芽勢；在第12 d 計算發(fā)芽率和相對發(fā)芽率，并測定幼苗株高和主根長，同時觀察幼苗的外傷癥狀，并測定幼苗葉片的丙二醛（MDA）含量。在觀察植物生長狀況時，采用目測估計法，將植株生長狀況分為4個等級：正常生長（無傷害），目測不到傷害癥狀；輕度傷害：僅中心部位失綠（以明顯淺于正常生長葉片的綠色作為失綠的判斷依據(jù)，下同）；中度傷害：葉片中心部位及外圍出現(xiàn)不同程度失綠；重度傷害：植株矮小，葉片失綠[10]。葉片MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[11]。

1.4 指標統(tǒng)計及計算

在觀察種子萌發(fā)狀況時，統(tǒng)計指標主要有發(fā)芽數(shù)、發(fā)芽勢、發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率，測定方法包括[11]：發(fā)芽勢（%）為3 d內籽粒萌發(fā)數(shù)與相應籽?？倲?shù)之比再乘以100；相對發(fā)芽勢（%）為重金屬處理組發(fā)芽勢與對照組發(fā)芽勢之比再乘以100；發(fā)芽率（%）為萌發(fā)數(shù)與籽粒總數(shù)之比再乘以100；相對發(fā)芽率（%）為重金屬處理組萌發(fā)率與對照組萌發(fā)率之比再乘以100。使用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，并使用Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 外源磷對銅脅迫下波斯菊種子萌發(fā)及幼苗生長指標的影響

由表1可知，隨著Cu2+濃度的增加，波斯菊種子的發(fā)芽勢和相對發(fā)芽勢先增加后減少。在Cu2+濃度為50 mg/L和100 mg/L時，發(fā)芽勢處于較高值；當Cu2+濃度到達200 mg/L及以上時，發(fā)芽勢和相對發(fā)芽勢較對照組明顯降低。隨著外源磷濃度升高，相同Cu2+濃度下的種子發(fā)芽勢和相對發(fā)芽勢基本呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但當Cu2+濃度在50 mg/L和100 mg/L時，隨外源磷輸入濃度增高，種子發(fā)芽勢和相對發(fā)芽勢也越高。

表1 外源磷對銅脅迫下波斯菊種子萌發(fā)及幼苗生長指標的影響

隨著Cu2+濃度增加，波斯菊種子的發(fā)芽率和相對發(fā)芽率先增加后減少。在Cu2+濃度為100 mg/L時，發(fā)芽勢到達最高值；當Cu2+濃度到達250 mg/L時，發(fā)芽勢和相對發(fā)芽勢最低，且與對照組相比明顯降低。同時，隨著外源磷濃度的提高，種子的發(fā)芽率和相對發(fā)芽率大致呈不斷降低的趨勢。在高濃度磷和銅處理的培養(yǎng)皿里，部分已萌發(fā)的種子葉片發(fā)褐、扭曲甚至死亡，意味著高濃度外源磷和銅處理對種子的初期萌發(fā)是有益的，但隨著時間推移，種子受到的傷害逐漸累積，最終導致其死亡。當Cu2+濃度較低（0 mg/L和10 mg/L）時，波斯菊幼苗的株高和根長較大，隨Cu2+濃度增加，幼苗株高和根長呈降低趨勢，當Cu2+濃度高于200 mg/L時，幼苗株高和根長與對照組相比明顯降低。當磷濃度為2 mg/L時，幼苗株高和根長比未施加外源磷下銅脅迫的各組幼苗略有增高，而高濃度磷（20 mg/L）則較未施加外源磷處理的降低。

2.2 外源磷對銅脅迫下波斯菊幼苗外傷的影響

波斯菊幼苗的外傷癥狀與培養(yǎng)液中Cu2+濃度直接相關。當Cu2+濃度不超過50 mg/L時，各組幼苗未出現(xiàn)明顯的外傷癥狀，且多株幼苗已長出心葉，生長狀況良好。當Cu2+濃度達到100 mg/L時，幼苗開始出現(xiàn)輕度外傷癥狀，有葉片中心失綠的現(xiàn)象。當Cu2+濃度到達200 mg/L時，幼苗傷害嚴重，開始出現(xiàn)明顯的中度傷害癥狀，且幼苗葉片的中心和外圍有不同程度的失綠，部分葉片開始出現(xiàn)紅褐色的斑點，植株也比較矮小。當Cu2+濃度達到250 mg/L時，幼苗出現(xiàn)重度傷害癥狀，葉片多處有紅褐色斑點，而且有的幼苗嚴重失綠，葉片呈黃褐色，植株矮小。與此同時，在高的外源磷濃度（20 mg/L）下，波斯菊受銅脅迫所造成的外傷癥狀也更加嚴重。

2.3 外源磷對銅脅迫下波斯菊幼苗丙二醛含量的影響

隨著Cu2+濃度增加，波斯菊幼苗葉片MDA含量不斷升高（圖1）。當外源磷濃度相同，而Cu2+濃度為0、10、50 mg/L 時，葉片MDA 含量無顯著差異；當Cu2+濃度達到100 mg/L及以上時，葉片MDA含量隨Cu2+濃度上升而明顯上升。同時，隨著外源磷濃度的升高，葉片MDA含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。當磷濃度為2 mg/L時，銅脅迫下各組葉片MDA含量均較另外兩組磷調節(jié)下葉片MDA含量低。

2.4 種子萌發(fā)和幼苗生長的最適磷濃度

將外源磷濃度和各組銅脅迫下波斯菊的發(fā)芽勢、根長和葉片MDA含量進行回歸分析，并計算銅脅迫下對種子萌發(fā)和幼苗生長促進效果最好的磷濃度平均值。由表2和表3可知，外源磷濃度在6.37 mg/L和9.08 mg/L 時對波斯菊發(fā)芽勢和根長的促進效果最好。由表4 可計算銅脅迫下各組最佳磷濃度平均值，當外源磷為10.65 mg/L時，葉片MDA含量最低，意味著外源磷緩解銅脅迫對幼苗危害的效果最好。綜合來看，在Cu2+濃度低于50 mg/L時，9.78 mg/L外源磷輸入對波斯菊的生長最為適宜；在Cu2+濃度高于100 mg/L時，5.25 mg/L外源磷對波斯菊的生長最佳。

表2 外源磷對銅脅迫下波斯菊種子發(fā)芽勢的回歸分析

表3 外源磷對銅脅迫下波斯菊幼苗根長的回歸分析

表4 外源磷對銅脅迫下波斯菊幼苗丙二醛含量的回歸分析

3 討論

土壤本身就含有一定量的重金屬元素，其中的銅元素是植物生長所必需的微量營養(yǎng)元素之一。土壤銅污染主要來自銅礦山和冶煉廢水[12-13]，只有當土壤累積的重金屬濃度超過植物需求，甚至超出其耐受極限，植物才會表現(xiàn)出受損傷的癥狀。研究重金屬脅迫下種子發(fā)芽及幼苗生長情況，觀察其能否在實驗模擬環(huán)境中順利生長，有利于判斷植物能否在環(huán)境脅迫下繁殖擴散，可以為重金屬污染土壤的植物修復與治理提供理論參考和技術支撐[14]。

在單一銅脅迫下，隨著Cu2+濃度升高，波斯菊種子的發(fā)芽勢、相對發(fā)芽勢、發(fā)芽率、相對發(fā)芽率、株高和根長均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，說明低濃度的銅不僅不會對植物生長造成損傷，而且有利于其發(fā)芽和生長[15]。當Cu2+濃度低于100 mg/L 時，其對波斯菊種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率有促進作用，說明在萌發(fā)期，適當?shù)你~添加有利于提高種子的發(fā)芽率[16]。與此同時，10 mg/L的Cu2+濃度可以促進波斯菊幼苗的長高和生根，而100 mg/L的Cu2+濃度則對幼苗株高和根長有顯著抑制作用，且這種抑制作用在根長方面比株高更明顯。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是由于根直接接觸銅溶液，銅毒害更容易作用于根部細胞，從而影響了根細胞的生長發(fā)育[17]。植物受重金屬脅迫的最直接體現(xiàn)就是其外傷癥狀，可以通過幼苗長勢、葉片顏色和形態(tài)來初步判斷其是否受到脅迫。當Cu2+濃度超過100 mg/L時，可以明顯觀察到波斯菊幼苗的受害情況，其逐漸表現(xiàn)為中度傷害和重度傷害，葉片有不同程度的失綠和紅褐色斑點，同時植株矮小且卷曲在一起，有根尖壞死現(xiàn)象。此外，在逆境脅迫下植物往往會發(fā)生膜脂過氧化作用，其中MDA是膜脂過氧化的最后產物，當其積累到一定量時就會對生物膜造成傷害[18]。因此，MDA是反映植物體抗氧化能力的重要參數(shù)，測量波斯菊幼苗MDA含量可以作為考察細胞受脅迫程度的指標之一。當Cu2+濃度較低時，波斯菊幼苗MDA含量變化不明顯，但是當Cu2+濃度超過100 mg/L時，MDA含量就明顯上升，說明了高濃度的Cu2+濃度脅迫會使幼苗發(fā)生膜脂過氧化以致于引起膜損傷。

此外，磷是植物生長過程所需的一種重要營養(yǎng)元素，也是影響植物生長和產量的主要因素之一，多施磷肥可以促進作物生長[19]。由實驗結果可知，低濃度的外源磷輸入對波斯菊的發(fā)芽勢、相對發(fā)芽勢、株高和根長等指標有促進作用，能降低幼苗MDA含量，減輕幼苗膜脂過氧化傷害。研究表明，添加磷酸鹽會緩解植物所受到的重金屬脅迫[20]，因此低濃度的外源磷輸入可能會改善銅污染區(qū)域的植物生長，減輕高濃度銅脅迫所引起的損傷。但是，隨著外源磷濃度的增加，植物受毒害的現(xiàn)象非但沒有減輕反而加劇了。本文研究發(fā)現(xiàn)，20 mg/L 磷濃度下波斯菊的發(fā)芽率和相對發(fā)芽率明顯降低，外傷癥狀加劇，且MDA含量也明顯升高，意味著在高磷水平下輸入銅，波斯菊將受到更嚴重的脅迫。在施加外源磷肥時，應先考慮土壤受銅污染的程度，以及對植物發(fā)芽勢和發(fā)芽率最有益的濃度。在低銅或無銅環(huán)境中，9.78 mg/L外源磷對波斯菊的生長最有益；在銅脅迫嚴重的環(huán)境中，5.25 mg/L外源磷則有利于波斯菊生長。在植物生命周期中，種子發(fā)芽和幼苗生長是關鍵階段，可能受到多種因素的脅迫，當環(huán)境中銅濃度較低時，波斯菊可以忍受較高磷濃度，較高磷濃度更能促進其生長，但是當其處于高銅脅迫下，可能較低磷濃度才有利于調節(jié)其生長，而過高磷濃度反而會和銅協(xié)同對種子萌發(fā)和幼苗生長造成更嚴重的傷害。因此，在添加外源磷肥來緩解生長在銅污染土壤的受害植物癥狀時，應該通過實驗來謹慎確定外源磷的含量。