冉李燕，施徐森，朱培英，李文貴

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，昆明 650201

戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）感染可引起戊型肝炎。大多數(shù)戊型肝炎病例為急性感染，一般預(yù)后良好。HEV 感染也可發(fā)展成重癥肝炎、暴發(fā)性肝衰竭或者慢性感染，主要通過糞-口途徑傳播，孕婦的發(fā)病率較高；它也能以膜相關(guān)的準(zhǔn)包膜形式（eHEV）在血液中循環(huán)[1]。戊型肝炎病毒科，分為正戊肝病毒屬（Orthohepevirus）和魚戊肝病毒屬（Piscihepevirus）。正戊肝病毒屬包含了A、B、C 和D 4 種（Orthohepevirus A to D）[2-3]，A 種在HEV 中所占比例最高，分為7 種基因型[4]。A 種基因I 型和基因II 型的自然宿主只有人，基因I 型毒株在世界范圍內(nèi)廣泛流行，分為6 個基因亞型（1a-1f），主要分布在亞洲、非洲和墨西哥等一些發(fā)展中國家，代表毒株為緬甸株?；騃I 型有2 個基因亞型，分別為2a 和2b，其代表株為墨西哥株。目前未發(fā)現(xiàn)有關(guān)其他區(qū)域中基因II 型的相關(guān)報道。基因III 型和基因Ⅳ型均為人畜共患型，基因III 型分為10 種基因亞型，同源性在78.74%～82.46%[5]，主要分布在美國及歐洲等其他發(fā)達國家，基因III 型除了能感染人以外還能感染家豬、野豬、兔子、老鼠、鹿、貓鼬等動物。兔源HEV 基因和其他基因III 型不同是由于基因組中有大量基因變異和插入片段[6]。Ⅳ型HEV 主要分布在亞洲國家，包括中國、泰國及日本等國家，與其他毒株的同源性為71.79%～77.38%，能從人、豬、野豬、牦牛、牛、綿羊和山羊中分離到?；騐 型和基因VI 型只能從野豬中分離，兩者同源性超過78%[7]，到目前為止，還沒有與這些基因型相關(guān)的人類感染。

哺乳動物和魚HEV 的基因組全長均為7.2 kb，禽HEV 的基因組大小為6.6 kb[8]。由3 個互相重疊的開放閱讀框（ORF1、ORF2、ORF3）構(gòu)成（圖1）。ORF1編碼含有1 693 個氨基酸的蛋白質(zhì)，主要編碼與戊肝病毒RNA 復(fù)制相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶、RNA解旋酶、蛋白酶和RNA 聚合酶等幾個比較保守區(qū)域的非結(jié)構(gòu)蛋白[9]；ORF2始于ORF1的3’端，編碼含有660 個氨基酸的衣殼蛋白，有重要的中和表位，可與受體結(jié)合，因而其功能與HEV 跨物種傳播、病毒與靶細胞的相互作用和免疫原性有關(guān)[10-12]；ORF3編碼產(chǎn)物為磷酸化蛋白與細胞骨架結(jié)合的蛋白，分子量大約14 kD，具有HEV 病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白基因，其N 端含有2 個疏水結(jié)構(gòu)域16-32 aa 和37-62 aa，ORF3通過第一疏水區(qū)與細胞骨架結(jié)合。

圖1 HEV 基因組結(jié)構(gòu)[13]

1 HEV ORF3 生物學(xué)

HEVORF3位于病毒基因組3’端，是一個小的磷蛋白，它與ORF2和ORF1基因段有部分重疊。ORF3蛋白在亞細胞部分可能參與細胞骨架的形成，與細胞骨架的形成具有密切的聯(lián)系。

研究表明，HEV ORF3 的核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均顯著高于ORF1和ORF2的同源性，且更易發(fā)生突變[14]。Laura 等首次描述了從基因型IV 人類HEV（TW6196E 株）的克隆cDNA 中成功地在體外和體內(nèi)挽救感染性HEV，證明基因型IV HEV 感染性克隆的實用性，為將來闡明HEV 跨物種感染的分子機制提供了方向；進行序列分析后顯示基因型ⅣHEV（TW6196E）與基因型ⅠHEV 株、基因型Ⅱ墨西哥株、基因型Ⅲ株和基因型Ⅳ株的核苷酸序列同源性分別為74%、73%、75%和94%[15]。

HEV ORF3 編碼的氨基酸中存在免疫應(yīng)答區(qū)。有學(xué)者通過人工合成肽方法發(fā)現(xiàn)，在ORF3蛋白的91-119 位之間的氨基酸包含一個免疫應(yīng)答區(qū)。有人用同樣的方法合成了墨西哥毒株和緬甸毒株的相同長度但不同位置的ORF3片段，經(jīng)過結(jié)構(gòu)分析后從每株篩選出2 個包含抗原位點最多的肽段，用這4 段抗原多肽與陽性血清做酶聯(lián)免疫吸附試驗。試驗結(jié)果確切證明了墨西哥株ORF3蛋白最強的免疫反應(yīng)區(qū)分布于C 端的第112-123 氨基酸之間，而緬甸株的最強免疫反應(yīng)區(qū)位于C 端112-117 氨基酸之間，這兩株病毒之間呈現(xiàn)出較大差異，這也進一步印證了ORF3蛋白與HEV 病毒株型特異性相關(guān)。

2 參與HEV 裝配與釋放

有研究表明，HEV ORF3 蛋白也至少含有4 個抗原表位，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要角色[16]。在ORF3第80 位絲氨酸上存在1 個磷酸化修飾位點，而磷酸化的ORF3蛋白可以與活化及調(diào)節(jié)蛋白激酶細胞信號途徑上的通路蛋白結(jié)合，包括蛋白激酶Fyn、Hck、Src 等，從而參與細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞的有絲分裂。而ORF3蛋白的75-88 位氨基酸和104-113 位氨基酸，存在2 個脯氨酸區(qū)域，其中1 個可以和SH3 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，該結(jié)構(gòu)域是Fyn、Hck、Src等蛋白激酶的共有部分，是各種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白與活化細胞表面之間連接的橋梁。位于ORF3C端的脯氨酸-絲氨酸-丙氨酸-脯氨酸（PSAP）晚期結(jié)構(gòu)域基序與一種ESCRT-I 蛋白即細胞TSG101（腫瘤易感基因-101）特異性相互作用，細胞TSG101 隨后招募ESCRT-II 和ESCRT-III 復(fù)合物，從而促進HEV 衣殼向多泡體（MVB）出芽。

其次，HEV ORF3 與病毒顆粒的裝配與釋放有關(guān)。HEV ORF3 蛋白完全暴露于細胞質(zhì)中的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，這對了解其在病毒生命周期中的相互作用提供了方向[17]；HEV ORF3 還可以作為病毒孔蛋白，釋放感染性因子[18]；ORF3蛋白磷酸化促進其與ORF2的相互作用，從而影響識別、釋放病毒顆粒[19]。

3 ORF3 與HEV 致病機制

HEV ORF3 可以通過抑制各種PRRs（模式識別受體）介導(dǎo)的NF-κB 信號通路，減弱LPS（脂多糖）誘導(dǎo)的細胞因子產(chǎn)生和趨化因子形成[20]。這些抗炎特性對于闡明巨噬細胞在慢性HEV 感染和肝硬化中的作用和機制具有重要意義。戊型肝炎病毒感染宿主細胞之后先表達ORF3蛋白，激活MAPKERK 通路，使宿主細胞始終處于增殖、分化狀態(tài)，而在病毒感染的后期才表達ORF2蛋白[21-22]。

HEV ORF3 蛋白具有免疫抑制的作用，而且ORF3的磷酸化影響其生物學(xué)功能。HEV ORF3 蛋白用一系列方式，抑制促炎因子和干擾素的表達。HEV ORF3 可降低IL-1b、COX-2、ICAM-1 和IFNα 的mRNA 和蛋白質(zhì)表達水平，從而促進先天性免疫反應(yīng)[23]。HEV ORF3 還能顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的炎性細胞因子（TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-8、IL-12p40 和IL-18）的產(chǎn)生，而這些炎癥細胞因子和趨化因子在HEV 病毒感染期間發(fā)揮重要作用[20]。HEV ORF3 蛋白也能保護細胞免受線粒體去極化和死亡，研究表明N 端缺失的人α1 微球蛋白/bikunin 前提蛋白（AMBP） 可以與ORF3蛋白發(fā)生特異性結(jié)合[24]。ORF3蛋白存在時能夠促進α1 蛋白對免疫系統(tǒng)的抑制作用，進而有利于戊肝病毒在肝細胞中的存活。Bikunin 是與ORF3蛋白強烈作用的配體，與ORF3蛋白的作用區(qū)域位于ORF3蛋白的C 端，該區(qū)域與ORF3蛋白二聚體形成位點和ORF3蛋白與SH3 的結(jié)合位點重疊，ORF3蛋白與bikunin 的結(jié)合抑制了bikunin 對腫瘤細胞擴散的阻礙作用。

此外，ORF3蛋白也被證實可以通過減弱急性炎性反應(yīng)來抑制宿主固有免疫，并可以增加免疫抑制因子如alpha-1-微球蛋白的分泌，抑制促炎細胞因子的表達[25-26]。HEV ORF3 蛋白還可以使干擾素信號通路的信號因子STAT1 的磷酸化不發(fā)生表達，而下調(diào)INF-α 的表達，以逃避免疫應(yīng)答，從而引起細胞中病毒的持續(xù)存在[27]。Huang 等[28]證明HEV 基因型IV 的ORF3誘導(dǎo)信號調(diào)節(jié)蛋白α 表達，該蛋白可阻斷IRF3（干擾素調(diào)節(jié)因子3，Interferon regulatory Factor 3）的磷酸化并抑制干擾素的誘導(dǎo)。

HEV ORF3 是宿主細胞釋放感染性病毒粒子所需的功能性離子通道。有研究表明，HEV 的ORF3與Ⅰ類病毒孔蛋白共用某關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的離子通道，而這在感染期間對病毒粒子釋放出細胞至關(guān)重要[29]。HEV ORF3 還通過影響整體膜蛋白和基底膜蛋白的表達來改變宿主細胞免疫過程，在病毒與細胞相互作用中發(fā)揮功能作用，影響宿主細胞凋亡和脂質(zhì)代謝[30]。有研究團隊通過RT-PCR、實時熒光定量PCR 及蛋白印跡等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了Ⅲ型HEV ORF3 通過調(diào)節(jié)TLR3（Toll-like receptor 3，Toll 樣受體3）和TRIF（Toll-interleukin 1 receptor homology-domaincontaining adapter-inducing interferon-8，β 干擾素TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白）的轉(zhuǎn)錄水平，從而促進病毒作用機體[31]。同時，HEV ORF3 可通過下調(diào)TLR3 和TLR7（Toll-like receptor 7，Toll 樣受體7）及相關(guān)的下游活性因子抑制宿主細胞I 型內(nèi)源性干擾素的生成[32]。因此對ORF3 的研究有助于進一步了解與防控戊肝病毒。

HEV 的ORF3 能夠顯著損傷巨噬細胞的吞噬作用，這就解釋了HEV 導(dǎo)致衰竭患者巨噬細胞的吞噬能力明顯弱于非HEV 導(dǎo)致的肝衰竭的臨床研究結(jié)果。研究表明HEV ORF3 可通過下調(diào)CD14（CD14 是巨噬細胞表面最常見的吞噬細胞受體之一）和CD64（Fcγ 受體（FcγR）家族的一員）的表達，顯著損害巨噬細胞的吞噬功能，這可能是通過抑制Janus 激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT）途徑信號通路的激活引起的，這為HEV 慢性感染提供了新的可能機制和治療靶點[33]。

4 HEV ORF3 蛋白在診斷和治療中的應(yīng)用

HEV ORF3 抗原表位多于ORF2，在HE 的診斷過程中具有重要意義。畢勝利等[32]曾利用大腸桿菌表達了ORF2、ORF3及ORF2和ORF3的嵌合蛋白，并將這3 種蛋白分別作為抗原與健康人血清做了間接ELISA 免疫試驗，結(jié)果顯示嵌合抗原與標(biāo)準(zhǔn)試劑盒的陽性符合率最高，利于結(jié)果判斷，而ORF3抗原的陽性符合率高于ORF2抗原，這說明ORF3基因編碼的蛋白含有較多的抗體結(jié)合位點。此外，王敏[34]成功篩選和制備了抗基因Ⅰ型HEVORF3蛋白的單抗，并成功偶聯(lián)辣根過氧化物酶（HRP），利用HRP 標(biāo)記單抗建立了檢測人血清中HEV 抗體的競爭ELISA 方法?？梢奜RF3抗原蛋白對于HEV 的免疫診斷極有價值，對HEV 疫苗和診斷試劑盒研發(fā)具有重要價值。

戊型肝炎嚴(yán)重危害人類健康，對戊型肝炎的預(yù)防，除切斷傳播途徑外，應(yīng)用疫苗是根本手段。HEV ORF3 是疫苗研制的一個重要方向。目前研究主要有DNA 疫苗，近年來己經(jīng)有HEV ORF2 和ORF3 蛋白在不同宿主內(nèi)成功表達的例子，如Maurer 等[35]在小鼠肌肉組織中施用一種新型合成的肌性腺相關(guān)病毒載體 （AAVMYO3）來表達HEV ORF3，從而開發(fā)針對HEV 和其他傳染性病原體的基于載體的疫苗，以補充傳統(tǒng)疫苗。研究表明，使用HEV-4 ORF3 蛋白與白細胞介素-1β 融合的重組疫苗可能對病毒的攻擊具有部分保護作用[36]。

還有研究表明，HEV ORF3 蛋白（包括禽HEV ORF3）免疫原性很高，可引起宿主體液反應(yīng)，大多數(shù)B 細胞表位位于HEV ORF3 的C 末端，這可能是研制亞單位重組疫苗的一個方向[31-37]。Yang 等[37]研究發(fā)現(xiàn)使用免疫原性O(shè)RF3 表位作為HEV 亞單位疫苗的附加成分之前，似乎需要對不同HEV 基因型的HEV ORF3 蛋白的抗原表位進行系統(tǒng)的定位，才能更好地發(fā)揮其作用。此外，其他新型疫苗如基因型IV 衍生肽疫苗也在處于不同的開發(fā)階段[38-40]。

5 結(jié) 語

世界各地區(qū)流行的HEV 病毒株在ORF3區(qū)雖然存在較大差異，但總體上具有很大程度的同源性。HEV 的ORF3 這種特性為將來的研究開發(fā)HEV疫苗和診斷試劑提供了可能。在戊型肝炎疫苗的研發(fā)過程中，也可以按照ORF3基因區(qū)的差異區(qū)分HEV 各流行株的差異，研發(fā)以O(shè)RF2抗原為主同時加入某一流行株的ORF3抗原的單價疫苗，或在ORF2抗原中加入多種流行株的ORF3的多價疫苗，能夠使疫苗和診斷試劑的效果更加準(zhǔn)確、有效，這可能成為未來疫苗研究的方向。