黃小佳，林廣津，張業(yè)懷，凌 丁

廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，南寧 530007

布氏桿菌病和結(jié)核病（以下簡(jiǎn)稱“兩病”）都是人畜共患病，養(yǎng)殖從業(yè)者、基層獸醫(yī)工作人員和教學(xué)實(shí)訓(xùn)場(chǎng)所的師生均屬于人畜共患病感染高危人群?！皟刹　钡牟≡赏ㄟ^人畜呼吸道、消化道、生殖道或皮膚、黏膜進(jìn)行傳播，人類接觸帶菌動(dòng)物或食用帶菌的乳制品或未煮的肉類均可被感染。為了做到源頭治理，確保師生和動(dòng)物的安全，2020年筆者所在課題組針對(duì)農(nóng)類院校養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)及其未來(lái)多功能作用的實(shí)際情況，利用動(dòng)科系微生物實(shí)驗(yàn)室，對(duì)養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)動(dòng)物進(jìn)行布氏桿菌和結(jié)核病調(diào)查，并對(duì)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行分析，為指導(dǎo)農(nóng)類院校養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)防控布氏桿菌病和結(jié)核病等人畜共患病的安全防護(hù)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為其他院校開展人畜共患病防控及凈化工作提供借鑒。

1 養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)基本情況

1.1 養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)內(nèi)部設(shè)施設(shè)備及周邊環(huán)境情況

養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)于2014年建成，2015年投入使用，主要由現(xiàn)代養(yǎng)豬場(chǎng)、臨床診療大棚、綜合養(yǎng)殖舍、化尸池等構(gòu)成。綜合養(yǎng)殖舍被柵欄劃分為牛舍、羊舍、犬舍，各欄舍之間是在同一環(huán)境下有公共的通道相通，同時(shí)各種動(dòng)物欄舍缺少防鼠防蟲設(shè)施，這種設(shè)計(jì)的缺陷給生物安全防控帶來(lái)了隱患。養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)周邊是農(nóng)學(xué)、園藝及中草藥實(shí)訓(xùn)基地，附近3 km 范圍內(nèi)無(wú)其他動(dòng)物飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)訓(xùn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用情況

養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)目前牛11 頭、羊19 只、馬5 匹、犬45 只、兔33 只、禽97 羽。由于受非洲豬瘟的影響，豬存欄為零。動(dòng)物的來(lái)源方式主要為購(gòu)進(jìn)，所有動(dòng)物的飼養(yǎng)模式為圈養(yǎng)。動(dòng)物的種類和數(shù)量隨實(shí)訓(xùn)課的開展時(shí)間、項(xiàng)目而變動(dòng)，實(shí)訓(xùn)課多、班級(jí)多，試驗(yàn)動(dòng)物總體數(shù)量多。

1.3 “兩病”歷年發(fā)病情況調(diào)查

為全面了解養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)“兩病”發(fā)生現(xiàn)狀，通過查資料及回訪曾經(jīng)在位工作的教師方式在校院內(nèi)開展“兩病”流行病學(xué)調(diào)查。歷年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)沒有“兩病”發(fā)病記錄，即使近幾年，隨著試驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖數(shù)量和實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所人員流動(dòng)性增加，“兩病”也未有發(fā)生及疫情報(bào)道。根據(jù)南寧市疾控中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2019年該學(xué)院發(fā)生了3 例人的結(jié)核病病例。但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，2011—2014年南寧市常住人口結(jié)核病累計(jì)28 893 例，年均發(fā)病率為0.0537%，總體上病例呈逐年上升趨勢(shì)[1]?？梢?，“兩病”防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻。

2 結(jié)核病和布氏桿菌病檢測(cè)

2.1 結(jié)核病檢測(cè)

①試驗(yàn)材料。（提純）牛型結(jié)核菌素（20 mL、2萬(wàn)/mL）、禽型結(jié)核菌素（凍干）均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。油標(biāo)卡尺；一次性1 mL 注射器、推剪、一次性帽子、一次性口罩、手套、記號(hào)筆等。

②檢測(cè)動(dòng)物。養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)所有存欄易感動(dòng)物。

③試驗(yàn)方法。試驗(yàn)方法及判定標(biāo)準(zhǔn)參照GB/T18646-2002（動(dòng)物結(jié)核病的操作規(guī)程）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行。采用結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（PPD）試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)根據(jù)動(dòng)物種類不同選擇不同的結(jié)核菌素、注射部位、注射劑量及判定標(biāo)準(zhǔn)，詳見表1。

④操作方法。所有待檢動(dòng)物都要進(jìn)行術(shù)前處理：將待檢動(dòng)物編號(hào)后在注射部位剪毛，并用油標(biāo)卡尺測(cè)量術(shù)部中央皮皺厚度，做好記錄。將結(jié)核菌素稀釋成所需要的濃度備用。注射方法：先以75%乙醇消毒注射部位，然后注射一定量結(jié)核菌素，如是皮內(nèi)注射，注射后局部會(huì)出現(xiàn)小包，如注射后不出現(xiàn)包時(shí)，應(yīng)另選大于15 cm 以外的部位或?qū)?cè)重做。觀察結(jié)果及處置：注射72 h 后，觀察注射部位是否有熱痛、腫脹等炎性反應(yīng)，并測(cè)量注射部位的皮皺厚度，做好記錄。對(duì)疑似反應(yīng)牛應(yīng)立即在另一側(cè)注射同批號(hào)同劑量結(jié)核菌素，再經(jīng)72 h 觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果判定：不同的動(dòng)物判定標(biāo)準(zhǔn)有所不同，詳見表1。

表1 養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)實(shí)訓(xùn)動(dòng)物結(jié)核桿菌病檢測(cè)注射部位、劑量及判定標(biāo)準(zhǔn)

⑤檢出可疑動(dòng)物的處理。凡判定為可疑結(jié)核病的動(dòng)物，過42 d 后再進(jìn)行1 次復(fù)檢，檢測(cè)結(jié)果是陰性，則判為陰性；檢測(cè)結(jié)果是陽(yáng)性，定為陽(yáng)性；若檢測(cè)結(jié)果仍呈可疑反應(yīng)者，則再間隔42 d 復(fù)檢1 次，結(jié)果仍為可疑反應(yīng)者，則按陽(yáng)性動(dòng)物處理[5]。復(fù)檢結(jié)果見表2。

表2 養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)實(shí)訓(xùn)動(dòng)物結(jié)核桿菌病初檢及可疑病例復(fù)檢結(jié)果 例

2.2 布氏桿菌病的檢測(cè)

①儀器與耗材。電熱恒溫培養(yǎng)箱、海爾冰箱、高速離心機(jī)LD-2.4、1.5 mL 塑料離心管、50～100 μL移液器、一次性5 mL 注射器、載玻片、吸嘴、試管架、試管等。

②診斷試劑。布氏桿菌虎紅平板凝集試抗原、試管凝集抗原、陽(yáng)性血清、陰性血清均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

③待檢動(dòng)物。全場(chǎng)存欄易感動(dòng)物。

④血液的采集及血清的制備。血液采集使用一次性注射器，采血量5 mL，不同實(shí)訓(xùn)動(dòng)物的采血部位、方法不同[6]，具體見表3。

表3 實(shí)訓(xùn)動(dòng)物采血部位、方法

采血完畢，將注射器針頭向下使整個(gè)注射器與地面垂直，并輕輕向上抽動(dòng)一下活塞，使血液與出口留有1.0 mL 左右的空隙，套上針頭套，室溫自然凝固后，放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱1 h 取出，放在室溫3～5 h 或冰箱24 h 存放后，就可看見淡黃色的血清析出。將注射器的針頭、針套取下后，將析出的血清慢慢注入一次性的塑料離心管中，并編號(hào)放入-26 ℃冰箱冷藏室，保存?zhèn)溆谩?/p>

⑤血清檢測(cè)方法。將所有待測(cè)動(dòng)物的血清先用布氏桿菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行初步檢測(cè)，結(jié)果判為疑似反應(yīng)的再用布氏桿菌病試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)檢。

⑥虎紅平板凝集試驗(yàn)方法及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18646-2002 動(dòng)物布氏桿菌檢測(cè)的操作技術(shù)進(jìn)行。先在滅菌潔凈的玻璃板上，用記號(hào)筆劃出三格，分別放入20 μL 虎紅平板凝集抗原，然后分別吸取等量的被檢血清、陽(yáng)、陰性血清分別放入并混勻，在5 min 內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集顆?，F(xiàn)象判為陽(yáng)性；無(wú)凝集現(xiàn)象，且液體呈均勻粉紅色者判為陰性。

⑦試管凝集試驗(yàn)方法及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。首先將血清稀釋成1∶12.5、l∶25、1∶50、1∶100 4 個(gè)稀釋度。加入等量稀釋好的抗原并混勻，此時(shí)血清稀釋度依次為l∶25、1∶50、1∶100、1∶200。同時(shí)，進(jìn)行陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及抗原對(duì)照試驗(yàn)，并配制比濁管。然后將所有的試管、對(duì)照管及比濁管充分振蕩后置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱24 h，取出觀察并記錄結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：參照比濁管及各試管上層液體透明度、管底沉淀物的量進(jìn)行判定。①++++：管底有明顯凝集物下沉，上層液體完全清亮；②+++：管底有凝集物下沉，上層液體75%清亮；③++：管底有凝集物，液體50%清亮；④+：管底有少量凝集物沉淀，液體25%清亮；⑤－：管底無(wú)凝集物，管內(nèi)液體均勻混濁[7]。

2.3 結(jié) 果

應(yīng)用結(jié)核菌素對(duì)養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)牛、羊、馬、犬、免、禽等6 種動(dòng)物共210 例進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為0.95%，說明該養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)實(shí)訓(xùn)動(dòng)物中存在結(jié)核病的感染（表2）。

應(yīng)用虎紅平板和試管凝集試驗(yàn)對(duì)113 份來(lái)自養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)牛、羊、馬、豬、犬、免的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出陽(yáng)性血清0 份，血清陽(yáng)性率為0，說明目前在養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)實(shí)訓(xùn)的動(dòng)物沒有感染布氏桿菌病，檢測(cè)結(jié)果詳見表4。

表4 養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)動(dòng)物布氏桿桿菌病檢測(cè)結(jié)果 例

3 討 論

3.1 結(jié)核病

應(yīng)用結(jié)核菌素對(duì)養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)牛、羊、馬、犬、免、禽等6 種動(dòng)物210 例進(jìn)行檢測(cè)，其中牛11 頭、羊19只、馬5 匹、犬45 只、免33 只、禽97 羽。檢出陽(yáng)性牛1 頭、陽(yáng)性犬1 只，其余羊、馬、免、禽未檢出陽(yáng)性，說明該養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)存在結(jié)核病感染，檢疫、隔離、消毒等綜合防控措施應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)，以達(dá)到凈化目的。

3.2 布氏桿菌病

本次采集各類動(dòng)物血清113 份。其中，牛11份、羊19 份、馬5 份、犬45 份、免33 份。所有的血清中未檢出陽(yáng)性，血清陽(yáng)性率為0，說明該養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)布氏桿菌病防控工作取得了一定的效果。

3.3 疾病來(lái)源

從調(diào)查中了解到，陽(yáng)性牛和犬都是歷年中標(biāo)商從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)進(jìn)，送貨時(shí)沒有帶有動(dòng)物檢疫合格的證明，送貨之后也沒有進(jìn)行“兩病”檢測(cè)。對(duì)于檢出的陽(yáng)性牛、犬立即報(bào)告學(xué)院并采取了隔離、深埋、消毒等無(wú)害化處理，并認(rèn)真做好登記備案及全場(chǎng)全面消毒等善后工作。

4 存在的問題及對(duì)策

4.1 存在的問題

養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)所是教學(xué)實(shí)訓(xùn)的重要基地，師生應(yīng)高度重視結(jié)核病、布氏桿菌檢測(cè)凈化和防控，但在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，該養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)還存在以下問題。

1）管理制度缺失。嚴(yán)格的管理制度是養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)正常運(yùn)行及動(dòng)物健康的重要保證。目前，該養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)各項(xiàng)安全管理制度未形成文件，包括試驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)進(jìn)原則、試驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)范、衛(wèi)生防疫制度、試驗(yàn)廢棄物無(wú)害化處理制度、生物安全教育培訓(xùn)及動(dòng)物檢疫制度等管理制度未出臺(tái)。即使購(gòu)進(jìn)的是健康動(dòng)物，但在養(yǎng)殖過程中有可能感染疫病。由于制度的不完善，該場(chǎng)管理工作形同虛設(shè)，導(dǎo)致常規(guī)的“兩病”檢測(cè)也被忽略。

2）實(shí)訓(xùn)廢棄物處理不徹底。養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)教學(xué)試驗(yàn)和科研過程中產(chǎn)生多種醫(yī)療廢棄物，如一次性PE手套、針頭、一次性塑料注射器及動(dòng)物的組織、血樣品、器官、尸體等。目前，只有一次性塑料注射器進(jìn)行收集，由專門的機(jī)構(gòu)來(lái)定期收集、處置，其余的多種廢棄物由學(xué)生課后直接作為生活垃圾扔入垃圾桶；化尸池設(shè)計(jì)存在容量小、使用不到1年動(dòng)物尸體很快填滿，無(wú)處安放的動(dòng)物組織樣品、器官、死亡動(dòng)物尸體則隨意填埋，易造成病原微生物擴(kuò)散。

3）生物安全教育不到位。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，多數(shù)教師、學(xué)生的生物安全的意識(shí)處于空白狀態(tài)，對(duì)人畜共患病的防范意識(shí)更是薄弱，表現(xiàn)在教師在進(jìn)行動(dòng)物解剖或臨床診斷時(shí)不戴手套和口罩，徒手進(jìn)行操作。學(xué)生也沒按要求進(jìn)行實(shí)訓(xùn)，未養(yǎng)成操作前戴手套的習(xí)慣，甚至存在一邊上課一邊吃食物的現(xiàn)象，離開實(shí)訓(xùn)場(chǎng)所時(shí)沒養(yǎng)成洗手的習(xí)慣。

4）試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源背景復(fù)雜。目前，教學(xué)實(shí)訓(xùn)所需要的試驗(yàn)動(dòng)物幾乎是從市場(chǎng)購(gòu)進(jìn)，而且由于試驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和動(dòng)物欄舍限制，存欄動(dòng)物種類和數(shù)量是隨實(shí)訓(xùn)需要而變動(dòng)，多數(shù)情況下課程教學(xué)需要時(shí)才從農(nóng)村或農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上購(gòu)買，而且是即買即用沒進(jìn)行任何檢疫。動(dòng)物的防疫狀況、健康狀況更無(wú)法了解。另外，部分試驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)進(jìn)時(shí)，只要求價(jià)格便宜，購(gòu)進(jìn)私自生產(chǎn)試驗(yàn)動(dòng)物，或未要求動(dòng)物中標(biāo)公司提供有關(guān)檢疫合格證明，這些均會(huì)導(dǎo)致一些攜帶病原微生物或已被感染的處于亞健康狀態(tài)的動(dòng)物流入養(yǎng)殖場(chǎng)所，給師生造成安全隱患。

4.2 對(duì) 策

“兩病”的防控是一項(xiàng)長(zhǎng)期而艱巨的工作，況且養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)承擔(dān)著重要教學(xué)任務(wù)，其“兩病”的防控除了采取養(yǎng)殖業(yè)常規(guī)的監(jiān)測(cè)、檢疫、隔離、消毒和科學(xué)管理等綜合性防治措施，堅(jiān)持自繁自育，全進(jìn)全出的管理體制外，還要做好以下工作。

1）完善并落實(shí)管理制度。完善養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)嚴(yán)格的生物安全管理制度；重視并落實(shí)師生的生物安全教育培訓(xùn)，讓師生意識(shí)到安全防護(hù)對(duì)于減少疫病傳播有著重要作用；從養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)的實(shí)際情況出發(fā)，把各項(xiàng)規(guī)定、要求及制度落到實(shí)處，設(shè)置生物安全管理崗位責(zé)任人，并層層落實(shí)安全管理責(zé)任；建設(shè)與改造養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)場(chǎng)動(dòng)物欄舍，設(shè)置有防外來(lái)生物入侵的設(shè)施，不同的動(dòng)物欄舍分區(qū)設(shè)計(jì)分別飼養(yǎng)，以避免交叉污染；規(guī)范化處理廢棄物，以減少污染物的擴(kuò)散，實(shí)現(xiàn)從源頭上減量控制。

2）加強(qiáng)檢測(cè)與凈化工作。每年春秋兩季針對(duì)健康動(dòng)物，利用學(xué)生實(shí)訓(xùn)的機(jī)會(huì)開展全面的檢測(cè)，通過檢測(cè)工作的開展，早期發(fā)現(xiàn)異常動(dòng)物，并采取針對(duì)性措施將傳染源清除，使“兩病”達(dá)到凈化的效果。在試驗(yàn)動(dòng)物引進(jìn)過程中，要求中標(biāo)公司選擇有產(chǎn)地檢疫合格的動(dòng)物引進(jìn)，動(dòng)物運(yùn)回后應(yīng)進(jìn)行30 d以上隔離觀察飼養(yǎng)，并進(jìn)行2 次免疫生物檢查，陰性者才能合群。