呂瓊芳，彭敏，梁惠明，黃少宏

（江門市藥品檢驗(yàn)所，廣東江門 529000）

斑蝥素是一種天然的防御性毒素，外用具有皮膚止癢，改善局部神經(jīng)營養(yǎng)及刺激毛根、促進(jìn)毛發(fā)生長的作用[1]。但斑蝥素的毒副作用大，安全范圍窄，皮膚大范圍外涂易導(dǎo)致中毒，表現(xiàn)為心肌損害，心腎器官實(shí)質(zhì)性損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害及衰竭癥狀[2]。

氮芥是一種生物烷化劑，有高度的化學(xué)活性，能直接作用于細(xì)胞，抑制細(xì)胞的迅速增殖，現(xiàn)作為廣譜抗腫瘤藥物應(yīng)用。同時(shí)氮芥屬于高毒類，是一種強(qiáng)起皰劑和局部刺激劑，能刺激皮膚毛發(fā)的生長。若鹽酸氮芥水溶液滴到皮膚上會(huì)被迅速透皮吸收，引起大皰紅腫疼痛甚至組織壞死潰瘍，嚴(yán)重時(shí)可通過呼吸道吸收引起氣道水腫和肺水腫[3]。

斑蝥素和氮芥均有促毛發(fā)生長的作用，易被非法添加在育發(fā)、防禿、洗發(fā)類產(chǎn)品中，但因毒副作用大，我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)》（2015年版）規(guī)定斑蝥素和氮芥為禁用組分[4]，進(jìn)行嚴(yán)格控制，在育發(fā)、防禿、洗發(fā)類產(chǎn)品中均不得檢出。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）原收載斑蝥素和氮芥的檢測方法是分開的，操作不方便。規(guī)范中含量測定采用氣相色譜法，樣品采用三氯甲烷提取?；瘖y品樣品的基質(zhì)體系復(fù)雜[5]，許多育發(fā)、防脫產(chǎn)品中添加了中藥提取物，其生物堿成分多，用三氯甲烷提取到的雜質(zhì)較多，常導(dǎo)致氣相色譜法測定時(shí)產(chǎn)生很多干擾峰，對(duì)疑似陽性樣品缺乏確證手段[6-9]，還有需經(jīng)過酸化除雜、堿性提取等繁瑣的樣品處理步驟，容易造成測定結(jié)果不準(zhǔn)確。

曾有文獻(xiàn)報(bào)道采用轉(zhuǎn)相萃取-氣相色譜法[10]、固相萃取-氣相色譜法[7]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11]測定斑蝥素或氮芥的含量，但少有文獻(xiàn)將斑蝥素和氮芥同時(shí)測定，且采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法定量比氣相色譜法排除干擾能力更強(qiáng)[12]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因其具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，已在化妝品定量及確證方面廣泛應(yīng)用[13-16]，有效解決了市場上種類繁多、性狀各異、成分復(fù)雜的各種育發(fā)類產(chǎn)品中斑蝥素、氮芥的檢測問題。

國家食品藥品監(jiān)督管理局2019 年第12 號(hào)通告中將斑蝥素和氮芥檢測方法合并，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，但筆者在新標(biāo)準(zhǔn)實(shí)際運(yùn)用中發(fā)現(xiàn)一些問題，針對(duì)出現(xiàn)的問題進(jìn)行合理的優(yōu)化，并對(duì)優(yōu)化后方法進(jìn)行方法學(xué)考察，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后方法適用性更強(qiáng)，可行性更好。同時(shí)對(duì)影響結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟展開探討，提出合理建議，以期為化妝品從業(yè)人員熟練運(yùn)用該方法提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Aglient 8890-7000D型，美國安捷倫科技有限公司。

電子分析天平：METTLER XS205DU 型，感量為0.01 mg，梅特勒托利多科技（中國）有限公司。

渦旋振蕩器：Vortex3000型，維根技術(shù)（北京）有限公司。

高速冷凍離心機(jī)：CT15RT型，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司。

超純水處理系統(tǒng)：Milli-Q 型，德國賽多利斯集團(tuán)。

鹽酸氮芥標(biāo)準(zhǔn)品：批號(hào)為U 40-2008063-02，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.69%，美國OST Research Chemicals公司。

斑蝥素標(biāo)準(zhǔn)品：批號(hào)為110783-201105，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.6%，中國食品藥品檢定研究院。

三氯甲烷：HPLC級(jí)。

氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉試劑：均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

化妝品樣品：市售。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水（符合GB/T 6682—2008 一級(jí)水要求）。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：HP-5MS 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司）；柱溫：程序升溫，初始溫度為50 ℃，保持1 min，以20 ℃/min速率升至150 ℃，保持5 min，再以30 ℃/min速率升至230 ℃，保持1 min；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；色譜-質(zhì)譜接口溫度：230 ℃；載氣：氦氣，體積分?jǐn)?shù)≥99.999%；電離方式：EI；電離能量：70 eV；測定方式：選擇離子檢測（SIM），氮芥定性離子為m/z106、63、120，定量離子為m/z106；斑蝥素定性離子為m/z128、96、70，定量離子為m/z128；進(jìn)樣體積：1 μL；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比為10∶1；溶劑延遲：5 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取斑蝥素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg、鹽酸氮芥標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，分別置于10 mL 容量瓶中，用三氯甲烷溶解并定容至標(biāo)線，制成斑蝥素和氮芥質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取斑蝥素和氮芥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1 mL于同一10 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容稀釋制成含斑蝥素和氮芥100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mL 至10 mL 容量瓶中，用三氯甲烷定容至標(biāo)線，搖勻，制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品預(yù)處理

稱取樣品0.5 g（精確到0.001 g），置于10 mL離心管中，加飽和氯化鈉水溶液2.0 mL，渦旋2 min，用0.5 mol/L 鹽酸溶液或0.5 mol/L 氫氧化鈉溶液將樣品溶液調(diào)節(jié)至中性，精密加入三氯甲烷 5 mL，渦旋混勻2 min，于4 ℃以10 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，取下層有機(jī)相，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾后，濾液作為待測溶液。

1.3.3 定量方法

依次將系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣，分別繪制斑蝥素與氮芥的定量離子色譜峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。取樣品溶液進(jìn)樣，將斑蝥素與氮芥的色譜峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中斑蝥素或氮芥的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理

按照國家食品藥品監(jiān)督管理局2019 年第12 號(hào)通告的標(biāo)準(zhǔn)，采用5 000 r/min 離心3 min，樣品尤其是膏霜類的分層不明顯、不完全。然后采用4 ℃以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min后，分層清晰。降低溫度、提高轉(zhuǎn)速及延長離心時(shí)間均有利于樣品快速、完全分層，提取更充分，測定結(jié)果更準(zhǔn)確。同時(shí)除雜更干凈，減少了基質(zhì)干擾及對(duì)儀器的污染，過濾時(shí)溶液也易于通過濾膜。

樣品提取時(shí)，需要加入飽和氯化鈉水溶液作為破乳劑，加入氯化鈉后需要充分渦旋使基質(zhì)分散，否則加入三氯甲烷提取時(shí)，乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，使得樣品的提取效率降低，影響測定結(jié)果準(zhǔn)確性。另外氮芥在pH 7 以上的水溶液中會(huì)發(fā)生水解而失活，而pH 值對(duì)斑蝥素測定結(jié)果影響較小，故實(shí)驗(yàn)提取時(shí)控制pH 6 ～7，提取效果較好[1]。

2.2 色譜條件優(yōu)化

改變色譜柱的程序升溫速率，由標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的15 ℃/min 提升至20 ℃/min，其余條件保持不變時(shí)，發(fā)現(xiàn)分析時(shí)間縮短約2 min（見表1），此時(shí)氮芥與溶劑峰仍能有效分離。樣品在分析前段有較多基質(zhì)峰，繼續(xù)提升升溫速率基質(zhì)峰易對(duì)目標(biāo)峰產(chǎn)生干擾，故升溫速率設(shè)置為20 ℃/min。針對(duì)三氯甲烷制備的樣品不夠穩(wěn)定的情況，縮短分析時(shí)間，重現(xiàn)性更好，同時(shí)可以提高試驗(yàn)效率。

表1 不同升溫速率時(shí)的分析時(shí)間

2.3 三氯甲烷試劑選擇

分別采用分析純?nèi)燃淄榕c色譜純?nèi)燃淄橹苽錁悠?，依次進(jìn)樣三氯甲烷空白溶液及用其制備的0.5 μg/mL氮芥標(biāo)準(zhǔn)品溶液，色譜圖分別如圖1～圖6所示。

對(duì)比圖1、圖2并提取質(zhì)譜圖，確認(rèn)6.304 min為氮芥峰，5.989 min為較大溶劑峰。

圖1 分析純?nèi)燃淄榭瞻咨V圖

圖2 分析純?nèi)燃淄橹苽涞鏄?biāo)準(zhǔn)品色譜圖

對(duì)比圖3、圖4，難以發(fā)現(xiàn)氮芥目標(biāo)峰。采用色譜純?nèi)燃淄橹苽涞母邼舛鹊牡娑ㄎ粏螛?biāo)和10μg/mL氮芥標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣得圖5、圖6。結(jié)合圖5、圖6 并提取質(zhì)譜圖確認(rèn)6.956 min 為氮芥峰，6.325 min為溶劑峰。

圖3 色譜純?nèi)燃淄榭瞻咨V圖

圖4 色譜純?nèi)燃淄橹苽涞鏄?biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖5 高濃度氮芥定位單標(biāo)色譜圖

圖6 色譜純?nèi)燃淄橹苽涞鏄?biāo)準(zhǔn)品色譜圖

對(duì)比兩個(gè)不同級(jí)別的三氯甲烷可見，分析純?nèi)燃淄槿軇┓遢^色譜純?nèi)軇┓逍『芏?，容易確定氮芥峰，但分析純?nèi)燃淄榈碾s質(zhì)峰較色譜純多，對(duì)不同基質(zhì)的樣品干擾會(huì)更大，且長時(shí)間使用易對(duì)色譜柱及儀器系統(tǒng)造成污染。標(biāo)準(zhǔn)方法采用分析純?nèi)燃淄?，建議選用色譜純的三氯甲烷，但盡量選擇在氮芥峰保留時(shí)間附近沒有溶劑峰或溶劑峰較小的三氯甲烷試劑進(jìn)行試驗(yàn)。另外三氯甲烷應(yīng)為無色透明液體，見光或久置易變黃，當(dāng)發(fā)現(xiàn)三氯甲烷變黃色，不建議使用。

2.4 線性方程和檢出限

取系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，依次進(jìn)樣，進(jìn)行色譜-質(zhì)譜分析，以系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制氮芥與斑蝥素定量離子色譜峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

取斑蝥素和氮芥質(zhì)量濃度均為 0.5 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，逐級(jí)稀釋，濾液進(jìn)入質(zhì)譜分析，測定并記錄其定量離子峰峰面積。以信噪比 3∶1 對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限。

斑蝥素和氮芥的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。

表 2 斑蝥素和氮芥的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

由表2 可知，斑蝥素、氮芥的質(zhì)量濃度在0.5～10 μg/mL 范圍內(nèi)與各自定量離子峰峰面積線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，方法檢出限均為0.005 μg/mL。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

稱取空白樣品0.5 g(精確到0.001 g)6 份，置于10 mL 離心管中，每份分別加入0.125 mL 含斑蝥素和氮芥100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按照1.3.2步驟進(jìn)行處理，制成斑蝥素和氮芥質(zhì)量濃度約為2.5 μg/mL 的混合加標(biāo)溶液，濾液進(jìn)入質(zhì)譜分析，計(jì)算回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表 3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可知，斑蝥素和氮芥的平均加標(biāo)回收率分別為102.6%、115.7%，通告中標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定斑蝥素、氮芥的加標(biāo)回收率均在80.0%～120.0%之間，滿足分析要求，6次平行測定結(jié)果的相對(duì)偏差分別為1.2%、2.1%，表明該方法精密度良好且準(zhǔn)確度較高，滿足分析要求。

三氯甲烷空白溶劑色譜圖、混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖、樣品色譜圖以及樣品加標(biāo)色譜圖分別如圖7～圖10所示。優(yōu)化后的方法線性、回收率、精密度、檢出限均能符合標(biāo)準(zhǔn)要求，表明優(yōu)化后的方法結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、適用性更強(qiáng)。

圖7 三氯甲烷空白溶劑色譜圖

圖8 混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖9 樣品色譜圖

圖10 樣品加標(biāo)色譜圖

2.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性

三氯甲烷易揮發(fā)，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用三氯甲烷溶劑制備的待測組分不夠穩(wěn)定。分別考察同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液（2.5 μg/mL）在臨用新制、常溫下和4 ℃冰箱內(nèi)的穩(wěn)定性，試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4 可知，常溫下放置短時(shí)間內(nèi)兩組分色譜峰面積變化明顯，且氮芥較斑蝥素色譜峰面積變化更大。為保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議測試溶液臨用新制，或者制備后，短時(shí)間存儲(chǔ)于4 ℃冰箱中，臨進(jìn)樣前取出，在12 h內(nèi)完成測定。

表4 同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液不同放置條件后進(jìn)樣的色譜峰面積

3 結(jié)語

結(jié)合化妝品中斑蝥素和氮芥的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法在實(shí)際應(yīng)用中遇到的問題，進(jìn)行合理優(yōu)化，優(yōu)化后的方法縮短了分析時(shí)間，提高了檢驗(yàn)效率，且方法的適用性更強(qiáng)，也保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，適合用于育發(fā)、防禿、洗發(fā)類化妝品中斑蝥素和氮芥兩種禁用組分的同時(shí)測定，為廣大技術(shù)人員在應(yīng)用化妝品中斑蝥素和氮芥檢測方法時(shí)提供參考。