田 凌，呂曉蕊，閻艷彩

宮縮乏力是產(chǎn)后出血的重要原因，產(chǎn)后出血嚴重或者搶救不及時可增加孕產(chǎn)婦死亡風險[1]。一般認為宮縮乏力性產(chǎn)后出血與子宮肌細胞收縮功能異常密切相關，而調(diào)控子宮平滑肌收縮的相關信號通路表達異常則是引起產(chǎn)后出血的關鍵因素[2]。RhoA/Rho信號通路屬于鈣敏化調(diào)節(jié)通路，大量研究已證實其在調(diào)控平滑肌收縮中發(fā)揮重要作用，可抑制平滑肌中肌球蛋白輕鏈磷酸酶的活性，以及誘導肌球蛋白輕鏈的磷酸化，從而維持或者促進平滑肌的收縮功能[3]。AKTAS等[4]研究發(fā)現(xiàn)抑制RhoA/Rho信號通路后，則可有效抑制縮宮素誘導的子宮平滑肌收縮力，表明RhoA/Rho信號通路參與了平滑肌的收縮調(diào)控。CPI-17(Thr38)、中電導鈣激活鉀通道(KCa3.1)、Krüppel樣因子4(Krüppel-likefactors,KLF4)均是維持平滑肌組織功能的重要蛋白，KLF4可促進平滑肌細胞的表型轉(zhuǎn)化，增加其的增殖和遷移能力，以及促進損傷修復，Thr38屬于鈣敏化調(diào)節(jié)因子，也可抑制平滑肌中肌球蛋白輕鏈磷酸酶活性等[5-7]。目前，關于Thr38、KCa3.1、KLF4與RhoA/Rho信號通路的關系，以及與宮縮乏力性產(chǎn)后出血的關系尚未完全明確，本研究將通過實例進一步探討，旨在研究宮縮乏力性產(chǎn)后出血的分子機制，從而為臨床治療提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年4月至2021年4于我院收治的80例宮縮乏力性產(chǎn)后出血產(chǎn)婦為觀察組，選擇同期80例無產(chǎn)后出血產(chǎn)婦為對照組。2組產(chǎn)婦的年齡、產(chǎn)次、孕周等一般資料差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)，具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會批準。

產(chǎn)后出血診斷標準[8]：參照樂杰主編的第7 版《婦產(chǎn)科學》。失血量采用稱重法以及羊水壓積測定法測量。稱重法：失血量(mL) =[胎兒娩出后接血敷料重(濕重) (g)-接血前敷料重(干重) (g)] /1.05(血液比重為g/mL) 。羊水壓積測定法：血羊水中血量(mL)=總羊水和血混合液量×羊水中血細胞比容/產(chǎn)前外周血中血細胞比容。

表1 2組產(chǎn)婦基線資料的比較

1.2 方法

1.2.1 標本采集 產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)時，預防性使用縮宮素前，剪取子宮下段切口上緣的子宮平滑肌，大小為 0.15 cm×0.15 cm×1.0 cm，立即放入0 ℃克亨氏溶液(Kreb-Henseleit，K-H)，于4 h內(nèi)測定肌張力。另取0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm大小的標本，采用蛋白質(zhì)印跡法以及實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應檢測相關蛋白、mRNA表示水平。

1.2.2 肌條等長張力測定 將剪取的標本懸掛于37 ℃克亨氏液體浴槽中，通入95%O2、5% CO2的混合氣體，連接張力換能器(成都儀器廠)，置前負荷2 g，平衡60 min后，記錄子宮平滑肌的收縮活動力、頻率以及幅度，采集時間為20 min。待肌條收縮穩(wěn)定之后，加入終濃度為1 μmol/L的Rho激酶抑制劑Y-27632(美國Sigma公司)，觀察子宮平滑肌收縮情況。

1.2.3 RhoA/Rho信號通路相關mRNA水平 采用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應法檢測肌條中RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡmRNA表達水平。按RNAiso Plus 試劑盒(Thermo Fisher Scientific)說明書提取標本中的總RNA，分光光度計定量 RNA 濃度。采用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄miRNA并進行PCR擴增，RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ、 mRNA以及內(nèi)參U6引物探針由大連寶生物工程有限公司提供，引物序列見表2。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，共45個循環(huán)。采用ABI Prisme Step-one熒光定量PCR儀(Applied Biosystems AB)進行檢測，以2-△△ct表示RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡmRNA相對表達量，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

表2 引物序列

1.2.4 蛋白檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡ以及Thr38、KCa3.1、KLF4表達水平，研磨消化標本組織，采用BCA法測定中蛋白濃度。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜上，分別按1:1 000的比例加入對應多克隆抗體(英國 Abcam 公司)，孵育過夜，次日洗膜，加入二抗-HRP標記的山羊抗兔 IgG(美國 Santa Cruze 公司)。顯影，定影，攝片，以β-肌動蛋白(β-Actin)為內(nèi)參蛋白，用凝膠定量分析軟件( Gel-Pro Analyzer 4) 讀取蛋白條帶灰度值，以目標蛋白/β-Actin的比值表示目標蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗和Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 2組產(chǎn)婦子宮平滑肌收縮活力情況比較 觀察組的子宮平滑肌收縮活動力、收縮頻率以及收縮幅度均低于對照組(P<0.05～P<0.01) ，加入Y-27632 后，2組子宮平滑肌收縮活動力均低于加入前(P<0.05)(見表3)。

表3 2組產(chǎn)婦子宮平滑肌收縮活力情況比較

2.2 2組產(chǎn)婦RhoA/Rho信號通路相關mRNA以及蛋白表達水平比較 觀察組的RhoA/Rho信號通路相關mRNA以及蛋白(RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ)表達水平均低于對照組(P<0.01)(見表4、5)。

表4 2組產(chǎn)婦RhoA/Rho信號通路相關mRNA水平比較

2.3 2組產(chǎn)婦Thr38、KCa3.1、KLF4表達水平比較 觀察組Thr38、KCa3.1、KLF4表達水平均低于對照組(P<0.01)(見表6)。

2.4 RhoA/Rho信號通路相關蛋白、收縮活動力與Thr38、KCa3.1、KLF4表達水平的關系 Pearson相關分析顯示，子宮平滑肌RhoA/Rho信號通路相關蛋白、收縮活動力分別與Thr38、KCa3.1、KLF4表達水平呈正相關性(P<0.05)(見表7)。

表5 2組產(chǎn)婦RhoA/Rho信號通路相關蛋白水平比較

表6 2組產(chǎn)婦Thr38、KCa3.1、KLF4表達水平比較

表7 RhoA/Rho信號通路相關蛋白、收縮活動力與Thr38、KCa3.1、KLF4表達水平的關系(r)

3 討論

既往認為，產(chǎn)婦子宮平滑肌中縮宮素的受體數(shù)量減少可導致子宮收縮潛能、收縮活動力下降，是引起產(chǎn)后出血的重要分子機制[9]。且研究也證實使用小劑量縮宮素可明顯增加產(chǎn)婦的子宮平滑肌收縮活動力和頻率，而進一步增加劑量或者提供縮宮素的濃度，刺激1 h后可導致縮宮素受體脫敏，進而引起收縮抑制[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)RhoA/Rho激酶信號通路參與了多種平滑肌收縮舒張功能障礙相關的疾病，Rho激酶屬于絲蘇氨酸蛋白激酶，存在ROCK Ⅰ、ROCKⅡ 2種異構體，是RhoA下游的重要靶分子，RhoA與ROCK 特異性結合后，通過磷酸化ROCK多個位點而活化信號通路，抑制平滑肌中肌球蛋白輕鏈磷酸酶活性，進而阻止肌球蛋白輕鏈的脫磷酸化，增強平滑肌收縮力[11]。本次研究結果顯示，觀察組的RhoA/Rho信號通路相關蛋白以及mRNA(RhoA、ROCK Ⅰ、ROCK Ⅱ)表達水平均低于對照組(P<0.01)，且進一步通過Pearson相關分析顯示通路蛋白表達水平與子宮平滑肌收縮活動力呈正相關(P<0.05)，表明RhoA/Rho信號通路可能參與調(diào)節(jié)子宮平滑肌收縮功能，但宮縮乏力性產(chǎn)后出血產(chǎn)婦的子宮平滑肌組織中RhoA/Rho信號通路處于低表達狀態(tài)，導致子宮平滑肌收縮力降低，進而引起宮縮乏力性產(chǎn)后出血。有研究[12]認為，正常妊娠孕婦于妊娠晚期以及產(chǎn)前時體內(nèi)縮宮素受體明顯增加，進而誘導RhoA的表達，而產(chǎn)后出血產(chǎn)婦的體內(nèi)縮宮素受體表達水平明顯降低，進而減少對RhoA的誘導作用，導致RhoA/Rho信號通路活化受阻。同時，也有研究[13]認為正常妊娠孕婦臨產(chǎn)前子宮平滑肌組織內(nèi)的一氧化氮水平顯著降低，而一氧化氮可通過激活環(huán)鳥苷酸依賴性激酶，進而抑制RhoA的膜轉(zhuǎn)位，阻止RhoA/Rho信號通路的轉(zhuǎn)導，而產(chǎn)后出血產(chǎn)婦的一氧化氮變化不明顯，相對正常產(chǎn)婦為高水平狀態(tài)，故而使得RhoA/Rho信號通路抑制的增加，子宮平滑肌收縮活動力減弱，最終引起產(chǎn)后出血。

Thr38是調(diào)節(jié)鈣敏感性的重要分子，作為肌球蛋白輕鏈磷酸酶的假底物，可與之結合而使得肌球蛋白輕鏈磷酸酶失活，進而抑制肌球蛋白輕鏈的去磷酸化，增加細胞質(zhì)中肌球蛋白輕鏈的磷酸化水平，促進肌動-肌球蛋白交聯(lián)以及肌動蛋白微絲骨架的聚合，最終誘導平滑肌細胞收縮[14-15]。KCa3.1是鈣激活鉀通道家族中的一員，細胞內(nèi)高鈣離子水平激活KCa3.1通道，從而促進鉀外流，調(diào)控細胞內(nèi)的鈣信號以及細胞膜電位，KCa3.1通道表達增加可促進平滑肌細胞的增殖、遷移等生理過程[16]。KLF4在多種平滑肌中具有調(diào)控作用，促進平滑肌細胞的增殖和分化，介導調(diào)控血管平滑肌表型轉(zhuǎn)換[17]。本次研究結果顯示，觀察組Thr38、KCa3.1、KLF4表達水平均低于對照組，進一步通過相關分析顯示Thr38、KCa3.1、KLF4表達水平與收縮活動力呈正相關關系(P<0.05)，表明Thr38、KCa3.1、KLF4與子宮平滑肌收縮功能密切關聯(lián)，其在宮縮乏力性產(chǎn)后出血產(chǎn)婦的子宮平滑肌組織中低表達，使得子宮平滑肌收縮力降低，進而導致宮縮乏力性產(chǎn)后出血。同時本次研究發(fā)現(xiàn)RhoA/Rho信號通路相關蛋白表達水平與Thr38、KCa3.1、KLF4呈正相關性，提示平滑肌組織中RhoA/Rho信號通路可能參與Thr38、KCa3.1、KLF4的表達調(diào)控，以上因子在調(diào)控平滑肌收縮力方面存在整合，相互影響活化狀態(tài)，共同參與宮縮乏力性產(chǎn)后出血的發(fā)生。

綜上所述，宮縮乏力性產(chǎn)后出血產(chǎn)婦子宮平滑肌組織的子宮平滑肌組織RhoA/Rho信號通路以及Thr38、KCa3.1、KLF4表達下降，且與收縮能力降低呈正相關性，兩者相互調(diào)控共同參與產(chǎn)后出血的發(fā)生。